沉降‑逆灌流‑放流偶联制备富含DHA油脂的方法及其专用细胞沉降槽技术

本发明专利技术涉及制备富含DHA油脂的方法及专用设备。在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中，在机械搅拌的方式下培养裂壶藻CGMCCNo.7693；从裂壶藻细胞中提取回收富含DHA的油脂；培养过程包括连续流加培养基质、细胞的沉降‑逆灌流及发酵液的周期性放流。专用细胞沉降槽包括两个间隔设置、且外形呈锥状的一、二级沉降槽，设置于一、二级沉降槽上的封盖，设于封盖上的开口，开设于一、二级沉降槽底部的出口，一级沉降槽上设有进液管，二级沉降槽上部设有上清液出液管，一、二级沉降槽经连通管相连，出口经浓缩细胞回流泵、管连接发酵罐。本发明专利技术解决了微藻连续培养技术中存在的细胞截留困难，细胞流失严重的问题，具有减少人工操作、容易自动化生产、生产周期短等优点。

【技术实现步骤摘要】
沉降-逆灌流-放流偶联制备富含DHA油脂的方法及其专用细胞沉降槽
本专利技术涉及一种富含DHA油脂的制备方法及专用设备。
技术介绍
DHA被誉为“脑黄金”，是人体必需的营养物质,对人体具有重要的生理功能，摄取不足会造成身体机能的不适。有关DHA的生理功能及其实际应用的研究已有较多报道。DHA是神经和视觉发育的一种必要营养元素，具有调节中枢神经系统的功能，还具有降血压、调节人体内血脂平衡、预防心血管疾病的功效。目前DHA的获取主要来自异养微藻的发酵培养。微藻发酵可以采用以下培养方式：分批式、流加分批式和连续式培养。分批式培养是底物基质一次性投加，将种子液接种到发酵罐中，在适宜条件下培养，反应完成后将全部反应物料取出的操作方式。流加分批操作是先将一定量的底物基质投加到发酵罐中，接种微生物培养一段时间后开始按要求流加底物，当反应终止时取出全部的反应物料的操作方式。连续发酵培养是指底物基质连续不断流加入发酵罐内，同时又把反应物料不断的取出，发酵罐内的反应液体积保持恒定，反应条件不随时间变化的操作方式。分批式发酵因其设备制作费用低，设备的通用性高，是发酵工业中使用广泛的方法之一，但是反应器的非生产周期长，每批发酵结束后都需进行洗罐和灭菌，由于频繁的高温高压灭菌，易使检测装置损伤及设备的腐蚀等损害，而且，每次发酵都需要预先培养种子，种子经逐级放大培养后才可以接种，增加了工艺步骤和生产成本，增添人工操作步骤而加大了染菌的风险，种子液培养过程中任何一级发酵罐染菌均会造成经济损失和生产周期的延迟。流加分批式发酵较分批式发酵有所提高，它可以控制反应器中底物基质的浓度，确保细胞生长所需的条件，产率可提高。但分批式流加受罐体积所限，持续的时间短，仍然不能克服非生产周期长的问题。相比之下，连续发酵更容易实现机械化和自动化节约劳动力，减少人工操作带来的污染，它只在发酵之初对发酵罐进行一次灭菌后便可长期运行，避免频繁灭菌对设备的损害，也省去了频繁的种子培养过程，因为底物基质的不断添加和反应液的不断排出，可控制发酵罐内代谢产物的浓度，避免底物限制和代谢产物抑制作用，保持细胞的高活性和高生长速率。微藻油脂生产的目标物为胞内产物，发酵培养的主要目的是收获高油脂含量的细胞，所以高细胞密度发酵是考虑因素之一。微生物发酵过程的连续培养通常都是在连续流入培养基的同时流出反应液,以维持罐内一定的反应液体积、细胞浓度和营养物质浓度,但是随着反应液不断排出的同时容易造成细胞的流失，导致短期内罐内可收集的细胞浓度较低。目前，间歇发酵生产多不饱和脂肪酸微藻油脂的方法已有较多报道。公告号为CN1648233A的专利技术专利中公开了一种以裂壶藻SR21的突变菌株OUC88发酵生产DHA的方法，以葡萄糖为碳源培养5天后细胞干重浓度达到25g/L，DHA产率为1.65g/L/d。申请号201210251850.X的专利技术专利申请通过补料间歇发酵培养Aurantiochytriumsp.SD116，获得70.43g/L的细胞浓度，DHA产量达到17.54g/L，DHA的产率为4.12g/L/d。公告号为CN101892160B的专利采用补料间歇发酵方法培养裂殖壶菌LX0809，发酵液的细胞干重可达到72.5g/L，DHA的产量达到15.3g/L，DHA产率为4.08g/L/d。随着技术进步，间歇补料发酵微藻生产DHA的产率逐渐提高，但这些专利生产的DHA占总脂肪酸的比例低于40％，饱和脂肪酸比例较高，使得油脂的品质有所降低；而且补料间歇发酵过程中DHA的产率是不稳定的，产率的提高极大程度上受到产物浓度和发酵时间等的限制。申请号为94106621.5的专利技术专利采用连续培养的方法培养ATCC30021藻种，发酵罐中细胞浓度达到15g/L，DHA产率为2.88g/L/d，该专利采用连续培养方法虽然解除了代谢产物的抑制作用，但是由于细胞的流失导致罐内细胞浓度较低，降低DHA的产率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种沉降-逆灌流-放流偶联制备富含DHA油脂的方法及其专用细胞沉降槽，通过连续流加基质和排出反应液有利于解除发酵底物限制和产物抑制导致的细胞活性降低，避免细胞生长进入停滞期和衰老期，有利于维持发酵罐内细胞的活性和脂肪酸的积累；通过细胞捕获返流避免细胞的流失，有利于生物量的迅速积累。本专利技术的整体技术构思是：沉降-逆灌流-放流偶联培养微藻制备富含DHA油脂的方法，在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中，在机械搅拌的方式下培养裂壶藻CGMCCNo.7693；从所述的裂壶藻细胞中提取回收所述的富含DHA的油脂；所述的培养过程包括如下工艺步骤：A、连续流加培养基质：将培养基质泵入发酵罐，发酵液由出料泵经出料口泵出罐外；B、细胞的沉降-逆灌流：步骤A中的发酵液进入无菌的细胞捕获收集装置进行细胞分离，分离后的细胞逆灌流返回发酵罐，废液被排出；C、发酵液的周期性放流：当发酵罐内的细胞达到额定浓度时，将发酵罐内的部分发酵液排出，并补充相同体积的培养基质。上述方法中专用细胞沉降槽，包括两个间隔设置、且外形呈锥状的一级沉降槽及二级沉降槽，设置于一级沉降槽及二级沉降槽上的封盖，开设于封盖上的开口，开设于一级沉降槽及二级沉降槽底部的出口，一级沉降槽上设有进液管，二级沉降槽上部设有上清液出液管，一级沉降槽及二级沉降槽经连通管相连，出口经浓缩细胞回流泵、管连接发酵罐。可以显而易见的是，沉降-逆灌流-放流偶联培养微藻制备富含DHA油脂的方法可以选用本专利技术中的专用细胞沉降槽，也可以采用常规的细胞沉降槽。相比常规使用的锥形细胞沉降槽，本专利技术提供的专用细胞沉降槽，可让细胞进行更有效的沉降灌流和培养液的放流。本专利技术中所采用的裂壶藻(Schizochytriumsp.)CGMCCNo.7693已于2013年6月9日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，该保藏单位的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术的具体技术构思还有：所述的步骤A是当发酵培养基中碳源浓度下降至1-5g/L时，向发酵罐中泵入培养基质，并使发酵培养基中碳源浓度维持在1-5g/L。可以显而易见的是，为缩短发酵周期、降低发酵成本，常见的技术实现方式是，所述的培养是将裂壶藻原始菌种经活化、扩大培养后制成种子液，将种子液接种至发酵培养基进行培养。所述的扩培及发酵培养基采用如下组份组成：葡萄糖10-20g/L,胰蛋白胨1-4g/L，酵母膏1-5g/L,氯化钠5-25g/L,硫酸镁1-5g/L,磷酸二氢钾0.5-5g/L,氯化钾0.1-1g/L,氯化钙0.3-0.6g/L，硫酸铵0.2-2g/L，碳酸氢钠0.05-0.5g/L，硼酸10-34.2mg/L，乙二胺四乙酸二钠20-60mg/L，氯化锰0.01-5mg/L，三氯化铁0.5-5.9mg/L，氰钴胺素0.1-1mg/L氯化锌0.2-2mg/L，氯化钴0.01-0.5mg/L，硫酸铜0.01-0.05mg/L，pH＝6-7；步骤A中流加的培养基质采用如下组份组成：葡萄糖30-50g/L，酵母提取物1-10g/L,氯化钠5-25g/L，硫酸镁1-5g/L,磷酸二氢钾0.5-5g/L,氯化钾0.1-1g/L,氯化钙0.3-0.6g/L,硫酸铵0.2-2g/L，碳本文档来自技高网...

【技术保护点】
沉降‑逆灌流‑放流偶联培养微藻制备富含DHA油脂的方法，在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中，在机械搅拌的方式下培养裂壶藻CGMCCNo.7693；从所述的裂壶藻细胞中提取回收所述的富含DHA的油脂；其特征在于所述的培养过程包括如下工艺步骤：A、连续流加培养基质：将培养基质泵入发酵罐，发酵液由出料泵经出料口泵出罐外；B、细胞的沉降‑逆灌流：步骤A中的发酵液进入无菌的细胞捕获收集装置进行细胞分离，分离后的细胞逆灌流返回发酵罐，废液被排出；C、发酵液的周期性放流：当发酵罐内的细胞达到额定浓度时，将发酵罐内的部分发酵液排出，并补充相同体积的培养基质。

【技术特征摘要】
1.沉降-逆灌流-放流偶联培养微藻制备富含DHA油脂的方法，在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中，在机械搅拌的方式下培养裂壶藻CGMCCNo.7693；从所述的裂壶藻细胞中提取回收所述的富含DHA的油脂；其特征在于所述的培养过程包括如下工艺步骤：A、连续流加培养基质：将培养基质泵入发酵罐，发酵液由出料泵经出料口泵出罐外；B、细胞的沉降-逆灌流：步骤A中的发酵液进入无菌的细胞捕获收集装置进行细胞分离，分离后的细胞逆灌流返回发酵罐，废液被排出；C、发酵液的周期性放流：当发酵罐内的细胞达到额定浓度时，将发酵罐内的部分发酵液排出，并补充相同体积的培养基质；所述的细胞捕获收集装置采用细胞沉降槽，细胞沉降槽包括两个间隔设置、且外形呈锥状的一级沉降槽(1)及二级沉降槽(2)，设置于一级沉降槽(1)及二级沉降槽(2)上的封盖(5)，开设于封盖(5)上的开口(4)，开设于一级沉降槽(1)及二级沉降槽(2)底部的出口(9)，一级沉降槽(1)上设有进液管(3)，二级沉降槽(2)上部设有上清液出液管(6)，一级沉降槽(1)及二级沉降槽(2)经连通管(8)相连，出口(9)经浓缩细胞回流泵(10)、管(12)连接发酵罐；所述藻种的固体保藏、扩培及发酵培养基的组成为:葡萄糖15g/L,胰蛋白胨4g/L，酵母膏1g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，氯化钾0.5g/L，氯化钙0.6g/L，硫酸铵2g/L，碳酸氢钠0.05g/L，硼酸15mg/L，乙二胺四乙酸二钠60mg/L，氯化锰5mg/L，三氯化铁0.5mg/L，氰钴胺素0.8mg/L，氯化锌0.2mg/L，氯化钴0.01mg/L，硫酸铜0.05mg/L，pH＝6.0，固体培养基加入琼脂15g/L；发酵开始后，当碳源浓度降至1-5g/L时开始进行连续流加培养基质和细胞沉降-逆灌流-放流偶联；流加的培养基成分为:葡萄糖50g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，氯化钾0.5g/L，氯化钙0.6g/L，硫酸铵2g/L，碳酸氢钠0.05g/L，硼酸15mg/L，乙二胺四乙酸二钠60mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜悦，陈璇，柳泽深，
申请(专利权)人：润科生物工程福建有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35