一种疫苗佐剂、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种水包油型疫苗佐剂、其制备及应用。所述的水包油型纳米乳疫苗佐剂，按照质量百分比包括0.1％～10％的油相、0.1％～10％的乳化剂、0.1％～3％的稳定剂、0.1％～3％的络合剂以及0.01％～10％的免疫增强剂。其制备方法包括以下步骤：(1)将免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中，获得水相；(2)将油相和乳化剂混合，获得油相；(3)将油相缓慢加入到水相中并持续搅拌，形成稳定的乳液；(4)调节乳液的pH值并定容得到初乳；(5)将初乳进行高速剪切和高压均质。本发明专利技术提供的疫苗佐剂，制备简单，使用方便，副反应小，用于稀释疫苗，尤其是猪瘟活疫苗，稳定性高，免疫效果好。

【技术实现步骤摘要】
一种疫苗佐剂、其制备方法及应用
本专利技术属于生物医药领域，更具体地，涉及一种疫苗佐剂、其制备方法及应用。
技术介绍
佐剂是指加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂也是一种抗原辅助剂,与疫苗共同使用可以明显提高疫苗的免疫效果。佐剂被用来增强疫苗免疫作用已有80多年的历史。免疫佐剂可辅佐免疫原刺激机体产生较早、较强、持久的免疫应答,理想的免疫佐剂应该能满足以下条件:在有效剂量内无毒或毒性极小；能刺激机体产生强大的体液免疫和/或细胞免疫应答；具有持久的免疫力；不诱导自身免疫；无致突变、致癌、致畸形作用等。虽然现在已有许多佐剂应用于动物,但还没有哪一种佐剂能完全满足以上要求。猪瘟是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的一种死亡率极高的急性败血性、接触性传染病，具有流行广泛、发病率高等特点，对养猪业危害极大。世界动物卫生组织将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，我国也将猪瘟定为一类烈性传染病，属于危害严重、需要采取紧急严厉的强制预防、控制和扑灭的动物疫病之一。预防猪瘟最有效的方法就是接种猪瘟疫苗。尽管猪瘟兔化弱毒苗的广泛应用及其它综合防治措施的实施,已控制了猪瘟的大规模流行，但近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势。目前市场上预防猪瘟的疫苗主要有三种：乳兔苗、细胞苗和淋脾苗，这三种均为活疫苗，在临床使用上有一定的功效，但是，疫苗的免疫成功率不高，除了疫苗质量、免疫程序、接种部位等因素以外，机体免疫功能低下以及免疫刺激不够是一个重要因素，某些病原感染导致机体的免疫功能低下或者免疫抑制。而且部分疫苗，尤其是一些油佐剂疫苗接种后免疫应激反应很大，使用一些低免疫应激反应佐剂是发展趋势。已有研究发现，免疫增强剂在猪瘟疫苗使用中能提高猪免疫力，对猪瘟疫苗的抗体水平有不同程度的影响。但是，目前尚无性能稳定的猪瘟活疫苗佐剂上市。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种疫苗佐剂、其制备方法及应用，其目的在于通过添加免疫增强剂，使水包油型纳米乳疫苗佐剂增强疫苗本身的细胞及体液免疫刺激能力，尤其是该疫苗佐剂还可能同时含有适用于提高猪瘟活疫苗效力的其他水性佐剂成分，进一步提高活疫苗的攻毒保护效力，解决目前疫苗刺激不够的技术问题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂为pH值在4.0至9.0之间的水包油型纳米乳，优选pH值在7.5至9.0之间的水包油型纳米乳，按照质量百分比包括0.1％～10％的油相、0.1％～10％的乳化剂、0.1％～3％的稳定剂、0.1％～3％的络合剂以及0.01％～10％的免疫增强剂。优选地，所述疫苗佐剂，其所述水包油型纳米乳其平均粒径在10nm～2000nm之间，优选在50nm～500nm之间。优选地，所述疫苗佐剂，其免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶、多肽、多糖或黄酮类；所述的多肽优选为白蛋白多肽、扇贝多肽和/或赛弗诺多肽；所述多糖优选为黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和/或壳聚糖；所述黄酮类优选为淫羊藿黄酮、金橘黄酮、白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮和沙棘黄酮；所述免疫增强剂更优选为黄芪多糖。优选地，所述疫苗佐剂，其乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例在1:2至2:1之间，优选在1:1至1.5:1之间。优选地，所述疫苗佐剂，其亲油性表面活性剂其亲水亲油平衡值在3至8之间；所述亲油性表面活性剂优选为脱水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇油酸酯、二缩甘露醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、单油酸甘油酯和单油酸缩山梨醇酯中的一种或多种；所述脱水山梨醇脂肪酸酯优选为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80或司盘85；所述亲油性表面活性剂更优选为司盘80或二缩甘露醇单油酸酯。优选地，所述疫苗佐剂，其亲水性表面活性剂其亲水亲油平衡值在8至15之间；所述亲水性表面活性剂优选为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或多种；所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯，优选为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85；所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，优选为泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407；所述亲水性表面活性剂更优选为吐温80、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或泊洛沙姆407。优选地，所述疫苗佐剂，其稳定剂为可溶性的二价无机盐，所述二价无机盐的阳离子为锰离子、钙离子、锌离子或亚铁离子，所述二价无机盐的阴离子为葡萄糖酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子或氯离子。优选地，所述疫苗佐剂，其络合剂为乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸钠，优选乙二胺四乙酸。优选地，所述疫苗佐剂，其油相为精加工烃类矿物油，优选为美孚白矿油Marcol52、美孚白矿油Marcol82、白矿油Drakeol5或白矿油Drakeol6；优选为美孚白矿油Marcol52或白矿油Drakeol5。优选地，所述的疫苗佐剂，还可以进一步包括一些添加剂，如抗氧化剂(二丁基羟基甲苯、维生素E、茶多酚等)、防腐剂(羟苯乙酯、苯甲酸钠等)。所述添加剂占纳米乳佐剂总重量的0％～0.5％按照本专利技术的另一方面，提供了一种所述的疫苗佐剂的制备方法包括以下步骤：(1)将配方比例的免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中，获得水相；(2)将配方比例的油相和乳化剂混合，获得含乳化剂的油相；(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续搅拌，使得形成稳定的乳液；(4)调节步骤(3)中获得的乳液的pH值并定容得到初乳；(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌，获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。优选地，所述的制备方法，其步骤(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中持续搅拌为磁力搅拌10min～40min。优选地，所述的制备方法，其步骤(5)所述高速剪切速率为8000～15000rpm，剪切时间为1～7min；所述高压均质压力为600～2000bar，循环次数为1～9次，优选800～1600bar压力条件下匀质3～5个循环。本专利技术提供的疫苗佐剂应用于猪瘟活疫苗的稀释，有助于发挥免疫作用。在5至6周的SPF级的Balb/c小鼠上对所述的纳米疫苗佐剂进行了安全性评价，结果发现，免疫之后无一只死亡，同样也未观察到明显的全身和局部反应，充分证明本专利技术的纳米疫苗佐剂是安全、可靠的。所述的纳米疫苗佐剂跟猪瘟活疫苗混合后免疫小鼠后，检测到CSFV抗体，并能诱导小鼠的明显的细胞和体液免疫反应。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于采用含有免疫增强剂的水包油型纳米乳，可与疫苗的混合使用，与现有的生理盐水稀释疫苗技术相比，能够取得以下有益效果：1.本专利技术的纳米疫苗佐剂，可以显著增强疫苗的细胞及体液免疫刺激能力，提高活疫苗的攻毒保护效力。以猪瘟疫苗为例，目前市场上预防猪瘟的疫苗主要有三种：乳兔苗、细胞苗和淋脾苗，并且这三种均为活疫苗，在临床使用上也显示出明显的功效。然而本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂为pH值在4.0至9.0之间的水包油型纳米乳，优选pH值在7.5至9.0之间的水包油型纳米乳，按照质量百分比包括0.1％～10％的油相、0.1％～10％的乳化剂、0.1％～3％的稳定剂、0.1％～3％的络合剂以及0.01％～10％的免疫增强剂。

【技术特征摘要】
1.一种疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂为pH值在4.0至9.0之间的水包油型纳米乳，由质量百分比为0.1％～10％的油相、0.1％～10％的乳化剂、0.1％～3％的稳定剂、0.1％～3％的络合剂、0.01％～10％的免疫增强剂和余量的水组成；所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例在1:2至2:1之间；所述亲油性表面活性剂其亲水亲油平衡值在3至8之间；所述亲水性表面活性剂其亲水亲油平衡值在8至15之间；所述的疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将配方比例的免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中，获得水相；(2)将配方比例的油相和乳化剂混合，获得含乳化剂的油相；(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续搅拌，使得形成稳定的乳液；(4)调节步骤(3)中获得的乳液的pH值并定容得到初乳；(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质，通过微孔滤膜过滤除菌，获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。2.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述水包油型纳米乳pH值在7.5至9.0之间的水包油型纳米乳。3.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述水包油型纳米乳，平均粒径在10nm～2000nm之间。4.如权利要求1或3所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述水包油型纳米乳，平均粒径在50nm～500nm之间。5.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶、多肽、多糖或黄酮类。6.如权利要求5所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述的多肽为白蛋白多肽、扇贝多肽和/或赛弗诺多肽；所述多糖为黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和/或壳聚糖；所述黄酮类为淫羊藿黄酮、金橘黄酮、白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮和沙棘黄酮。7.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例在1:1至1.5:1之间。8.如权利要求5所述的疫苗佐剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫，梁孔贤，许琦，万江陵，杨祥良，
申请(专利权)人：华中科技大学，武汉百思凯瑞纳米科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42