用于对番茄斑萎病毒进行特异性检测及绝对定量的引物和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于对番茄斑萎病毒进行特异性检测及绝对定量的引物和方法，属于植物病毒检测领域。本发明专利技术以番茄斑萎病毒为研究对象，建立了更加快速、简便、准确、灵敏的植物病毒定量检测方法，包括如下步骤：(1)根据标准质粒建立标准曲线；(2)获得待测样品cDNA；反转录合成cDNA；并以cDNA为模板、TSWV-113F/TSWV-113R引物进行荧光定量PCR，得到待测样品的Ct值；(3)利用标准曲线计算待测样品中番茄斑萎病毒的拷贝数。该方法能够在4-5小时内对样品中的番茄斑萎病毒进行准确定量，不仅节约了时间、简化了实验步骤，还有利于在植物发病之前采取相应的补救措施，防止该病毒在作物间广泛传播所带来的巨大经济损失。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种对疑似感染番茄斑萎病毒的待测植物样品进行斑萎病毒绝对定量的方法，包括如下步骤：(1)制备斑萎病毒质粒标准品标准曲线，步骤如下：以确定感染番茄斑萎病毒的植物为阳性样品，提取总RNA，反转录成阳性样品cDNA；以阳性样品cDNA为模板、以番茄斑萎病毒特异性引物TSWV‑482F/TSWV‑482R扩增番茄斑萎病毒特异性片段；回收该特异性片段并克隆到常用骨架载体中得到质粒标准品；测质粒标准品的浓度，根据质粒的拷贝数(copies/uL)＝6.02×1023(copies/mol)×质粒浓度(g/uL)/质粒分子质量(g/mol)，得出质粒标准品的病毒拷贝数；梯度地稀释质粒标准品，以荧光定量引物TSWV‑113F/TSWV‑113R对不同浓度的质粒标准品进行荧光定量PCR，得出各浓度质粒标准品的Ct值；以各浓度质粒标准品对应的病毒拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线；所述番茄斑萎病毒特异性引物TSWV‑482F/TSWV‑482R，序列为：5’‑TCTGGTAGCATTCAACTTCA‑3’，5’‑CTTCTCTGGTGTCATACTTCT‑3’；所述荧光定量引物TSWV‑113F/TSWV‑113R的序列为：5’‑CTTGCCATAATGCTGGGAGGTAG‑3’/5’‑TCCCGAGGTCTTTGTATTTTGC‑3’；(2)提取所述待测植物样品的总RNA，反转录合成cDNA；并以cDNA为模板、TSWV‑113F/TSWV‑113R引物进行荧光定量PCR，得到待测植物样品的Ct值；将所述Ct带入所述标准曲线中计算待测植物样品中番茄斑萎病毒的拷贝数。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴青君，赵巍巍，张治军，徐宝云，谢文，王少丽，张友军，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11