本发明专利技术公开了一种检测番茄斑萎病毒的RT-HDA引物，试剂盒及方法，所述引物为序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID No：2所示的寡核苷酸序列。所述的试剂盒包含如下组分：1）RT-HDA扩增反应液；2）无RNA酶的去离子水，作为空白对照；3）阳性对照样品：含番茄斑萎病毒RNA模板；4）阴性对照样品：不含番茄斑萎病毒的健康番茄组织RNA模板；检测方法包括下列步骤：1）待检样品RNA提取，2）番茄斑萎病毒RNA进行RT-HDA扩增；3）电泳检测结果及描述及判定。本发明专利技术的HDA检测方法更快、更快捷，安全可靠，与PCR相比不需要PCR仪，设备要求简单，适用于对番茄斑萎病毒进行快速检测确证，可广泛应用于农业生产及环境中的疫情监控及进出口贸易中该类病毒的监测及检测。
【技术实现步骤摘要】
检测番茄斑萎病毒的RT-HDA引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及一种检测番茄斑萎病毒的RT-HDA引物，试剂盒及方法，属于病毒检测
。
技术介绍
近年来，番前斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSffV)以其广泛的寄主范围和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。在20世纪60?80年代，该病毒曾在欧美及非洲的烟草和番茄上大流行，每年的发病率为20%?50%，造成高达数10亿美元的损失。在美国夏威夷、巴西、意大利和南非，TSWV在20世纪80?90年代的流行曾导致番茄、莴苣等作物近乎绝产。近年来，番茄斑萎病毒属病毒特别是TSWV，已成为全世界引起多种经济作物和观赏植物极大经济损失的重要因子。 我国目前种植的辣椒、洋葱、生菜等蔬菜种子很多来自于世界各地，尤其是番茄种子基本依赖进口，进口国别包括美国、日本、荷兰、泰国等国，这些进口国目前都有番茄斑萎病毒的发生与报道，我国口岸曾于2012年在进境的种子中截获TSWV病毒。而传统的TSWV检测及确证方法一般通过生物寄主、形态学试验判定植株是否具有植物病毒，这些方法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要。 在现有的核酸检测方法中，常用的有聚合酶链式反应(常规PCR和实时荧光PCR)，该方法灵敏、特异，但需要高品质热循环仪，而且因为温度循环导致较长。其他新开发的核酸扩增方法，比如 NASBA(nucleic acid sequence-based amplificat1n)、3SR (self-sustained sequence replicat1n)> SDA(strand displacementamplificat1n)等，在扩增循环，都有各自的创新点。NASBA和3SR使用一系列转录和反转录过程来循环以避免高温变性作用，SDA则使用限制性内切酶和修饰过的模板来循环扩增。虽然它们的敏感性都很高，可以检测并扩增小于10个拷贝的核酸样本，但是它们还有各自需要克服的缺点。技术要求、材料要求、技术本身特异性缺陷等方面严重束缚了这些技术的推广应用。因此，有必要提供一种更便捷，检测灵敏度更高的检测番茄斑萎病毒的方法。 依赖解旋酶恒温基因扩增技术(Helicase-Dependent IsothermalAmplificat1n, HDA)是2004年B1Helix的研宄人员模拟动物体内DNA的复制机制专利技术的一种新的体外恒温扩增技术。该技术利用DNA双链解旋酶打开双链DNA，同时在单链结合蛋白(SSB)DNA聚合酶的作用下，扩增靶片段，实现目的基因的体外扩增。HDA技术与其他基因扩增技术比较，具有如下优势: 1、与PCR技术相比，HDA技术模仿自然界DNA合成方式，凭借DNA解旋酶解开双链并完成扩增，而传统PCR是通过变性-退火-延伸过程的多次循环实现。由于原理的不同，使得HDA的优点尤其突出:①HDA反应在同一温度下进行，因而不需要昂贵的PCR仪，有利于在基层实验室推广应用。②由于只用一种温度扩增使得HDA反应时间明显缩短，仅需Ih左右。③HDA技术采用去除了 5’ -3’外切酶活性的BstDNA聚合酶，该酶兼具耐高温性、高效扩增反应性、极好的条带均一性及高准确性等特点，不易引起非特异性扩增，使得HDA技术具有更高的特异性和敏感性。 2、与其他恒温扩增技术相比，HDA是一种真正意义上的恒温基因扩增方法。例如:SDA、LAMP等均需要热变性，而HDA不需此部即可完成反应。此外，尽管HDA的反应体系组稍显复杂，但操作简单易学。尤其引物设计简单。SDA技术需要四条引物，同时还需要经修饰过的dNTP作底物，而且靶序列的复杂性也限制了其应用范围。LAMP技术具有简单、快速、高效、特异性强等优点，但引物设计复杂，难度较大，且对靶序列的要求较高:目的序列长度限制在200bp左右，从中设计的四至六条引物Tm互有差别，且能识别6个不同的区域。而HDA技术的引物设计与常规PCR方法相同，仅需两条普通引物即可。总之，与同类新型PCR技术相比，HDA技术更简单，更有效，具有良好的应用前景。 据最新报道，现有的HDA技术还包括一种不仅可扩增大分子DNA片段，还可直接扩增完整环状质粒DNA的环HDA法(T和circular heIicase-dependentamplificat1n, cHDA)。利用cHDA的特异性扩增环状DNA能力，可直接从病原体中检测含有环状DNA的病毒等。HDA技术与荧光标记技术相结合还可以实现实时检测。研宄表明，HDA技术能够扩增微生物基因组DNA、RNA、质粒DNA和cDNA等。HDA方法扩增能力强，现用的Uvrd系统扩增可达100多万倍，能够从基因组DNA中检测到低于10个拷贝的靶基因。综上所述，HDA技术是一种不可比拟的真正实用的恒温基因扩增方法，有望成为一种重要的诊断工具。 目前，国内外还没有关于HDA检测植物病毒的研宄。我们将首次建立起快速检测番前斑萎病毒的HDA技术。该专利技术成果将有望成为植物疫病分子诊断领域的突破性技术，是植物流行病学检测技术体系的进一步完善和发展。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:一种用于检测番茄斑萎病毒的RT-HDA扩增引物及试剂盒，即利用RT-HDA扩增方法检测番茄斑萎病毒的引物和试剂盒，克服其他检测方法在病毒检测的局限性，为番茄斑萎病毒的检测提供有效工具，能够快速、特异性强、灵敏度高而且低成本的检测番茄斑萎病毒。 为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是: 本专利技术提供的番茄斑萎病毒RT-HDA检测引物组，包括引物对HD-Pl和HD-P2，它们的碱基序列分别为SEQ ID NO:1?2。 本专利技术的试剂盒，包含如下组分: I) RT-HDA扩增反应液: 包含10 X RT-HDA 缓冲液 5 μ L、MgS04 (10mM) 2 μ L，NaCl (500mM) 4 μ L，dNTP (3.0mM) 3.5 μ L，酶混合液酶混合液(DNA 解旋酶 0.4 μ g,AMV-Bst 40U 和 ThermoScript反转录酶 4U) 3.5 μ L、RNase-Free Water 20 μ L、HD-Pl 和 HD-P2 各 I μ L0 其中10\奶-邢六缓冲液包括1011111101/1 KCL、20mmol/L Tris-Cl (Ph8.8，25°C )，所述引物HD-Pl和HD-P2分别具有序列表SEQ ID NO:1?2的碱基序列； 2)阳性对照样品:含番茄斑萎病毒RNA模板，作为阳性模板； 3)阴性对照样品:不含番茄斑萎病毒的健康番茄组织RNA模板，作为阴性模板； 4)空白对照样品:为DEPC去离子水； 使用以上试剂盒，检测样品中番茄斑萎病毒的方法，依次包括下列步骤: I)待检样品RNA提取 采取Trizol法或RNA提取试剂盒抽提RNA模板， 2)番茄斑萎病毒RT-HDA扩增 A:在反应管中依次加入待检模板RNA 10 μ L和RT-HDA扩增反应液40 μ L，充分混匀； B:在65°C恒温反应条件下，进行RT-HDA扩增反应90min ； 扩增时，应设立3个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测番茄斑萎病毒的引物，其特征在于，所述的引物组的序列分别为序列表SEQ ID NO:1～2所示，其中SEQ ID NO:1为检测番茄斑萎病毒的引物HD‑P1,SEQ ID NO:2为检测番茄斑萎病毒的引物HD‑P2。
【技术特征摘要】
1.一组检测番茄斑萎病毒的引物，其特征在于，所述的引物组的序列分别为序列表SEQID NO:1?2所示，其中SEQ ID NO:1为检测番茄斑萎病毒的引物HD-P1，SEQ ID NO: 2为检测番茄斑萎病毒的引物HD-P2。2.权利要求1所述的引物组在检测番茄斑萎病毒中的应用。3.权利要求1所述的引物组在制备检测番茄斑萎病毒的试剂盒中的应用。4.一种检测番茄斑萎病毒的RT-HDA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含如下组分: 1)RT-HDA扩增反应液: 包含 10 X RT-HDA 缓冲液 5 μ L、MgS04(100mM)2 μ L，NaCl (500mM)4 μ L，dNTP (3.0mM) 3.5 μ L，酶混合液 3.5 μ L,RNase-Free Water 20 μ L、HD_P1 和 HD-P2 各 I μ L ; 其中 10\奶-邢六缓冲液包括1011111101/1 KCL、20mmol/L Tris-Cl (pH8.8, 25°C),所述引物HD-Pl和HD-P2分别具有序列表SEQ ID NO:1?2的碱基序列； 所述的酶混合液包括DNA解旋酶0.4 μ AMV-Bst 40U和ThermoScript反转录酶4U ； 2)无RNA酶的去离子水，作为空白对照模板； 3)阳性对照样品:含番茄斑萎病毒RNA模板，作为阳性模板； 4)阴性对照样品:不含番茄斑萎病毒的健康番茄组织RNA模板，作为阴性模板。5.一种应用权利要求4所述的试剂盒检测样品中番茄斑萎病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤: 1)待检样品RNA提取 采取Trizol法...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴兴海，陈长法，魏晓棠，纪瑛，林超，唐静，宋涛，王英超，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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