本发明专利技术公开了一种甲型H1N1猪流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。本发明专利技术通过序列多重比对，针对甲型H1N1(2009)猪流感病毒、欧亚类禽型H1N1猪流感病毒、经典型H1N1猪流感病毒及人源H1N1猪流感病毒的保守基因片段，设计出特异性强的检测甲型H1N1猪流感病毒的引物和探针，用于实时荧光RT-PCR检测。实验结果表明使用本发明专利技术所提供的特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针用于检测甲型H1N1猪流感病毒特异性高，灵敏度可达2.6×10-5ng/反应，不仅可以对待测猪群的的鼻腔拭子、肺脏，气管等组织样品进行检测，还可检测鸡胚尿囊液，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用，可成为甲型H1N1猪流感病毒疫病诊断和流行病学调查的有用检测工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鉴定甲型H1N1(2009)猪流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒。本专利技术属于生物
技术介绍
猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病。世界各地流行的猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)包括3种主要的亚型：H1N1、H3N2和H1N2亚型，其中又包括不同的基因型：经典型H1N1[Classical swine H1N1influenza A virus,(CS)H1N1]、人源H1N1流感病毒[Human H1N1influenza A virus,(hu)H1N1]、欧亚类禽型H1N1[Eurasian avian-like swine H1N1,(EA)H1N1]、甲型H1N1流感病毒[pandemic(H1N1)2009，pH1N1/2009]、人源H3N2、基因重排的H3N2以及多基因型的H1N2亚型等。猪呼吸道上皮细胞上既有禽流感病毒的受体，唾液酸a-2,3-半乳糖苷(SA a 2,3Gal)又有人流感病毒的受体唾液酸a-2,6-半乳糖苷(SA a 2,6Gal)，被认为是流感病毒的“混合器”。猪流感病毒HA受体结合位点具有与人、禽流感病毒受体相同的结合特异性，决定了SIV不仅可感染猪，同时也具有感染禽和人类的能力。猪流感的另一大危害是其与人流感密切相关，引起历史上流感3次大爆发的病原H1N1、H2N2和r>H3N2亚型流感病毒，均由当时存在于禽类的流感病毒和人的流感病毒在猪体内重组或突变而来。研究表明，不同亚型流感病毒感染同一宿主后，可以发生基因片段的重排，通过基因重排有可能产生高致病性毒株和高传播能力毒株。我国是动物流感高发国家，动物与人接触频繁，动物流感病毒在一定条件下可以跨越种间屏障传播给人，并可能适应人作为宿主，进一步可能造成人际之间的传播。H1亚型猪流感病毒曾经是人间流感大流行毒株的供体。2009年3月底至4月中旬,墨西哥、美国等地接连暴发感染pH1N1/2009流感病毒疫情,在短时间内造成全球人的感染，序列分析结果显示,该流感病毒为四重配病毒,其基因组8个片段分别来源于近年来流行的4种病毒:NA和M片段来源于1979年以来流行于欧亚大陆的类禽型猪流感病毒；HA、NP和NS片段来源于北美普通猪流感病毒；PB2和PA片段来源于禽流感病毒；而PB1来源于人季节性H3N2流感病毒。2009年5月在加拿大猪群中很快检测到了这种病毒，该病毒目前已经在北美、欧洲及亚洲等多个国家的猪群中分离到，并且在一些国家已经分离到pH1N1/2009流感病毒与传统猪流感病毒的基因重配病毒。我国于2009年11月份从猪群中监测到该新型病毒的存在，之后的监测结果显示pH1N1/2009流感病毒在猪群中已经定植，并且监测发现pH1N1/2009流感病毒和CSH1N1病毒、(EA)H1N1病毒、H1N2病毒发生了单基因片段和多基因片段重排的新型重组变异毒株，这些病毒的流行对我国养猪业发展造成了巨大的经济损失的同时，也对人类的生命和健康造成了严重的威胁。一旦这些重组病毒获得较强的传播特性和高的致病力并能感染人类，就有可能引起新的世界性流感大流行。因此，建立一种针对甲型H1N1猪流感病毒的检测试剂盒，既可满足猪群流感病毒监测的需要，又可为人间流感大流行的预警提供一种有效的检测方法。目前SIV诊断方面也有大量的研究报道，但研究内容仅限于通用型基因检测和亚型检测，根据我国SI流行病学调查情况，目前我国猪群中存在(EA)H1N1、pH1N1/2009、(CS)H1N1及(Hu)H1N1等不同谱系的H1亚型SIV，其中(EA)H1N1、pH1N1/2009为优势毒株，但是目前没有完全可区分pH1N1和(EA)H1N1荧光定量RT-PCR诊断方法。本专利技术建立的荧光定量RT-PCR旨在为我国猪群中存在的pH1N1快速诊断提供方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定甲型H1N1猪流感病毒的实时荧光检测方法及试剂盒。本专利技术的一种甲型H1N1猪流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括一对特异性引物和荧光探针，所述特异性引物由上游引物和下游引物组成，所述特异性引物和荧光探针的序列如下：上游引物：5’-AAATCTAGTGGTACCGAGATATGCA-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-GGGAGGCTGGTGTTTATAGCAC-3’(SEQ ID NO.2)；特异性探针：5’-F-CAATGGAAAGAAATGCTGG-Q-3’(SEQ ID NO.3)，其中F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。在本专利技术中，优选的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷混合物，DNA聚合酶，逆转录酶以及RNA酶抑制剂，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。在本专利技术中，优选的，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。在本专利技术中，优选的，所述试剂盒中还包括甲型H1N1猪流感病毒基因的DNA标准品，所述标准品的核苷酸序列如下所示：5’AGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATA 3’(SEQ ID NO.4所示)。在本专利技术中，优选的，所述特异性探针中F与Q的选择为下列组之一：F为FAM，Q为BHQl；F为VIC，Q为BHQl；F为TAMRA，Q为BHQ2；F为ROX，Q为BHQ2；F为CY5，Q为BHQ3。进一步的，本专利技术还提出了以上任一项所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定甲型H1N1猪流感病毒试剂中的应用。上述特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针的制备方法也属于本专利技术的保护范围。该制备方法具体可包括将所述特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针中所述三条单链DNA分别单独包装的步骤。所述鉴定或辅助鉴定pH1N1猪流感病毒的试剂盒的制备方法也属于本专利技术的保护范围。该制备方法具体可包括如下步骤:将所述特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针中所述三条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内:DNA聚合酶和4种dNTP(dATP，dTTP,dCTP和dGTP)。本专利技术所提供的特异性PCR引物对及TaqMan荧光探针可检测不同来源的pH1N1流感病毒，尤其适合检测pH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲型H1N1猪流感病毒荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于包括一对特异性引物和荧光探针，所述特异性引物由上游引物和下游引物组成，所述特异性引物和荧光探针的序列如下所示：上游引物：5’‑AAATCTAGTGGTACCGAGATATGCA‑3’；下游引物：5’‑GGGAGGCTGGTGTTTATAGCAC‑3’；特异性探针：5’‑F‑CAATGGAAAGAAATGCTGG‑Q‑3’，其中F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
【技术特征摘要】
1.一种甲型H1N1猪流感病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括一对特异性引物和荧光探针，所述特异性引物由上游引物和下游引物组成，所述特异性引物和荧光探针的序列如下所示：
上游引物：5’-AAATCTAGTGGTACCGAGATATGCA-3’；
下游引物：5’-GGGAGGCTGGTGTTTATAGCAC-3’；
特异性探针：5’-F-CAATGGAAAGAAATGCTGG-Q-3’，其中F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷混合物，DNA聚合酶，逆转录酶以及R...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈艳，杨焕良，陈化兰，乔传玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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