一种带鱼指纹图谱的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种带鱼指纹图谱的构建方法，将带鱼制备成供试品溶液，经过高效液相色谱仪奋力检测，获得带鱼的指纹图谱；所述方法包括供试品溶液的制备、高效液相色谱测定、标准指纹图谱的确定。本发明专利技术利用HPLC色谱法建立了带鱼的指纹图谱，方法性考察表明该方法可靠、重复性较好，符合指纹图谱的要求；本发明专利技术检测带鱼产地的方法操作简单、检测效率高、检测结果可靠性好、快速、精确度高，准确率高达92.7%以上。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，将带鱼制备成供试品溶液，经过高效液相色谱仪奋力检测，获得带鱼的指纹图谱；所述方法包括供试品溶液的制备、高效液相色谱测定、标准指纹图谱的确定。本专利技术利用HPLC色谱法建立了带鱼的指纹图谱，方法性考察表明该方法可靠、重复性较好，符合指纹图谱的要求；本专利技术检测带鱼产地的方法操作简单、检测效率高、检测结果可靠性好、快速、精确度高，准确率高达92.7%以上。【专利说明】
本专利技术涉及一种操作简单、检测效率高、检测结果可靠性好、快速、精确度高基于 高效液相色谱的带鱼指纹图谱的构建方法。
技术介绍
带鱼（rricAia/YAs 又称牙带、白带鱼、刀鱼等，属鱼纲S卢形目带鱼科动 物，为暖温性中下层集群洄游鱼类，栖息于水深60-100m泥质海底，以各种鱼类、毛虾和乌 贼等为主要食物，有明显的昼夜垂直移动现象，广泛分布于世界的温、热带海域（以印度洋 和西太平洋居多）。 带鱼鱼体显著侧扁，延长成带状，尾细长如鞭，一般体长6(Γ120厘米、体重 20(Γ400克。头窄长而侧扁，前端尖突。两颌牙发达而尖锐。眼大、位较高，眼间隔平坦、中 间微凹。体表光滑，鳞退化成表皮银膜，全身呈富有光泽的银白色，背部及背鳍、胸鳍略显青 灰色。背鳍长，起点于鳃孔后上角沿背部齐长，臀鳍不明显，只有鳍棘刺尖外露。无腹鳍。 带鱼肉嫩体肥、味道鲜美，只有中间一条大骨，无其他细刺，食用方便，营养价值 高，是倍受人们喜爱的一种海洋鱼类。具有补虚、解毒、止血等功效，可用于体虚、乳汁分泌 不足、外伤出血等症。同时，从带鱼表皮银膜中提取的咖啡因，可做照相工业和医药工业原 料；提取的6-硫代鸟嘌呤制成药或治急性白血病，胃癌及淋巴肿瘤等，带鱼肉还可制取水 解蛋白注射液。 带鱼是我国四大经济鱼类之一，我国东海、黄海、渤海、南海和北部湾均产，其中以东海 产量最大（70%，2006)，南海产量较少，浙江、山东沿海是产量较多的海区。1990年以前，东 海区最高年产量为52. 8万吨（1974年)，浙江省为34万吨，占东海区的64%，1974年后产 量开始滑坡，全省产量在20-30万吨之间，1989年降至最低，只有19. 5万吨。自1989年开 始，实施产卵带保护区，并开发外海带鱼资源，1995年又开始伏季拖网和帆张网休渔措施， 是90年代以来的带鱼产量增长较快，从1990年24万吨1995年上升到58万吨，超过历史 最高水平，2000年达到65万吨，2010年达118万吨。但是，带鱼产量的增长，并不意味着带 鱼资源的好转，带鱼个体小型化，低龄化严重，冬汛捕捞群体当龄鱼比例从1967年20. 5%， 1982年上升到59. 3%，90年代前期平均为71. 1%，90年代后期达到78. 2%，目前达到82. 3%， 可见带鱼捕捞群体以当龄的捕捞群体为主，带鱼产量的增长靠强化捕捞所得，带鱼资源处 于生长型过度捕捞状态。 舟山带鱼，由于其所处海域独特的地理位置和水文环境，鲜度和质地同其他地区 相比独占鳌头，是全国首批海鲜类地理标志证明商标的拥有者。但是，一些不法商贩为牟取 利益，常以其他产地的带鱼冒充舟山带鱼，以次充好，严重损害了消费者利益，破坏了舟山 海鲜的商誉。 于1997年9月发表水产学报第21卷第3期中有一篇关于东海带鱼种群鉴别研究 的报道，通过对取样于东海不同海区29批2168尾带鱼鱼体的各项形态性状的观察、计测、 并应用数学方法对性状差异进行统计比较和群体间聚类分析，结合有关资料进行综合分 析。结果表明：东海带鱼，不论近海或外海的群体，相互间的形态特征基本酷似，呈现出密切 的关系，从而确认它们为同一种群。这种方法来检测带鱼产地或者带鱼种群时间花费过久。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了解决现有带鱼产地难确定、没有一种快速有效检测带鱼产 地方法的缺陷而提供一种操作简单、检测效率高、检测结果可靠性好、快速、精确度高基于 高效液相色谱法的带鱼指纹图谱的构建方法。 为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案： ，将带鱼制备成供试品溶液，经过高效液相色谱仪奋力 检测，获得带鱼的指纹图谱； 所述方法包括如下步骤： a) 供试品溶液的制备：取不同产地的带鱼样品，以提取溶剂回流提取，离心，取上清液 加在碱性氧化铝层析柱上，收集过柱液，再以水洗脱，合并过柱液及水洗脱液，过滤，作为供 试品溶液； b) 高效液相色谱测定：吸取步骤a)得到的供试品溶液至高效液相色谱仪测定，得到不 同产地的带鱼指纹图谱； c) 标准指纹图谱的确定：测定了 5个不同产地的带鱼共28个带鱼样品高效液相色谱 指纹图谱并进行比较，得到由其共有峰构成的带鱼样品高效液相色谱指纹图谱，该指纹图 谱具有的共有特征峰有13个与7个特征峰。 在本技术方案中，水产品的营养成分及含量与特定的水生环境密切相关，品种相 同的产品可能产地不同，对不同产地产品特征因子进行分析，有利于原产地产品特色的形 成，并进一步制定相应的保护措施。文献中报道较多的是利用高效液相色谱法（HPLC)技术 对中药产地和真伪进行研究，中药指纹图谱是现代中药质量控制和品质鉴定的新技术，为 样品质量评价问题和产地归属问题提供了新的方法和思路，而利用高效液相色谱法对水产 品指纹图谱研究较少。 HPLC色谱法分离度高，能把复杂的化学成分进行分离并进行分析，这些高低不同 的色谱峰包含着众多的信息，出峰的位置及高度（或峰面积）分别代表着特定化学物质及 其含量的多少，故而整个色谱图可表征该样品所含有化学成分的多少及含量的大小。 分别把各产地带鱼HPLC色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版 (2004)(国家药典委员会），建立各产地带鱼HPLC指纹图谱共有模式。根据相似度评价，得 到各产地带鱼HPLC参考指纹图谱，确立了 13个共有峰和7个特征峰，通过各产地带鱼主要 共有峰相对保留时间及相对峰面积的比较，发现样品间相对保留时间差异较小，而相对峰 面积有着显著差异，说明了各产地带鱼含有物质至少有13种以上相同，但是化学成分含量 因海域不同存在着差异。 作为优选，步骤a)中带鱼样品选择体表富有光泽、腮呈鲜红、粘液透明、眼球饱满、 角膜清晰的带鱼，取1. 5-5. 0g带鱼背部肌肉样品在0到-10°c下干燥12-18h，备用；然后加 入5-6倍带鱼质量的去离子水搅拌均与得到带鱼肉浆，用带鱼质量的0. 36-0. 97%的内切蛋 白酶与鱼肉浆质量的0. 2-0. 33%的壳聚糖，35-40°C下搅拌30-240min，pH为5. 5-8. 5 ;搅拌 结束后，调节pH至10-11. 2,保持30-45min后将pH调节至中性，然后4000rpm下离心，取上 清液，将上清液完全干燥后得到带鱼样品固体，将带鱼样品固体加入至提取溶剂中回流提 取，离心，取上清液加在碱性氧化铝层析柱上，收集过柱液，再以水洗脱，合并过柱液及水洗 脱液，过滤，作为供试品溶液。 在本技术方案中，在带鱼样品用提取溶剂提取前，先对带鱼进行内切蛋白酶酶解， 使得在后续提取工艺中可以更快速的将需要的成分提取出来，以便在高效液相色谱分析 时，得到更准确的数据与指纹图谱。 作为优选，提取溶剂为无水乙醇、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特征在于，将带鱼制备成供试品溶液，经过高效液相色谱仪奋力检测，获得带鱼的指纹图谱；所述方法包括如下步骤：    a）供试品溶液的制备：取不同产地的带鱼样品，以提取溶剂回流提取，离心，取上清液加在碱性氧化铝层析柱上，收集过柱液，再以水洗脱，合并过柱液及水洗脱液，过滤，作为供试品溶液；b）高效液相色谱测定：吸取步骤a）得到的供试品溶液至高效液相色谱仪测定，得到不同产地的带鱼指纹图谱；c）标准指纹图谱的确定：测定了5个不同产地的带鱼共28个带鱼样品高效液相色谱指纹图谱并进行比较，得到由其共有峰构成的带鱼样品高效液相色谱指纹图谱，该指纹图谱具有的共有特征峰有13个与7个特征峰。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周宇芳，郑斌，肖金星，相兴伟，杨会成，孟志娟，徐珊，
申请(专利权)人：浙江省海洋开发研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33