本发明专利技术涉及一种检测Liddle’s综合征相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测Liddle’s综合征相关基因的产品，该试剂盒包括：A.独特设计并制备捕获探针，针对基因SCNN1B、SCNN1G全部外显子片段；B.设计独特带有标签序列的接头；C.通用引物对探针序列进行PCR扩增；D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便，极大地降低了测序检验成本。
【技术实现步骤摘要】
-种检验Liddle' s相关基因突变的试剂盒
[〇〇〇1] 本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种检测Liddle' s 相关基因突变的体外诊断试剂盒，是一种应用于新一代测序平台技术的一种Liddle' s相 关基因突变的试剂盒。 技术背景 Liddle's综合征是一种常染色体显性遗传的单基因高血压病，其临床特征是早发 的高血压，低血钾，低肾素，低醛固酮血症，对上皮钠通道（ENaC)抑制剂阿米洛利或氨苯蝶 啶敏感，而对醛固酮受体拮抗剂螺内酯不敏感，常规高血压药物治疗效果欠佳。 Liddle' s综合征是一种罕见疾病，但其发病率可能要比预期的高，是单基因遗传 性高血压病的最常见病因之一。该病在不同种族均有病例报道，包括高加索人、亚洲人、非 洲人等。美国一项研究对149例血钾低于4. Ommol/L且患有高血压的退伍军人进行调查， 结果显示Liddle' s综合征发病率高达6% [1]。 Liddle' s综合征的分子基础为编码ENaC的基因（SCNN1B和SCNN1G)获得性功能 突变，最常见的突变是β或Y亚单位C羧基末端和富含脯氨酸的高度保守序列PY基序 (Ρ :脯氨酸，Υ :酪氨酸，L :亮氨酸）断裂、错义、提前产生终止密码或移码突变所致。ΡΥ基 序基因突变可导致ENaC持续活化，钠重吸收增加，血压升高，醛固酮和肾素分泌受到抑制， 从而出现Liddle' s综合征的一系列临床症状。其关键性的病理生理改变为：远端肾小管 的ENaC对钠的重吸收增加，细胞外液容量扩张。 Liddle's综合征患者临床表现为高血压、低血钾、代谢性碱中毒，血浆肾素和醛固 酮水平在正常范围或降低，大多有明确的高血压家族史。服用阿米洛利对控制高血压有效 可支持对该病的诊断。近年来也有一些轻中度高血压伴或不伴低血钾的Liddle' s综合征 患者的报道。 Liddle's综合征患者具有发病年龄小，容易出现靶器官损害，故对于年龄< 30岁 的高血压患者，一旦有高血压家族遗传史，且具有低血浆肾素活性、低血钾等特征时，应考 虑进行SCNN1B和SCNN1G基因筛查，有助于早期病因诊断，早期指导治疗，一旦确诊，给予限 盐和口服阿米洛利或氨苯蝶啶可收到良好的治疗效果，从而避免恶性心血管事件的发生。 由于Liddle' s综合征一直被视为一种罕见病，患者长期被误诊，造成血压控制困 难，大量使用降压药导致药物副作用增加，早年发生心肾功能不全等靶器官损害，脑卒中甚 至猝死。 [l]Tapolyai M, Uysal A, Dossabhoy NR, et al. High prevalence of Liddle, s syndrome phenotype among hypertensive US Veterans in Northwest Louisiana. J Clin Hypertens (Greenwich). 2010 ；12 (11) :856-860. 对于Liddle' s综合征的鉴别诊断传统的方法主要依靠生化检查和影像学检查。 这些手段存在很大的缺点： 1.检查种类多； 2.灵敏度和特异度低； 3.易受药物和精神状况等因素的影响； 4.检测时间要求苛刻； 基因诊断的优势在于： 1.方便，安全，快捷：仅抽取2-4毫升血： 2.任何时间都可以检查； 3.不限制饮食，服药，任何身体状况都可以检测； 4.相比反复，多项传统检查，更为经济；[〇〇19] 5.发病前，疾病极早期诊断的唯一方式； 6.源头确诊，一次检测，终身受益。 这一切都揭示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。 近年，大规模 DNA 平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了 以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的特权能够被众多研究 人员分享。 但是直接使用大规模DNA平行测序平台检测的成本目前仍然令个人难以承受。本 专利技术可以同时把多个甚至几十病人的Liddle' s相关基因精确的选择性捕获，然后用于大 规模测序平台，可以极大地降低基因诊断的成本，使之广泛应用于临床成为可能。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种检验Liddle' s相关基因突变的目标捕获再测序的试 剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。 为实现上述目的，本专利技术采用捕获目的SCNN1B、SCNN1G基因全部外显子片段以 及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液； dNTP ;高保真聚合酶；链霉素磁珠。本专利技术采用的技术方案是：一种新的目标捕获再测序方 法，包括以下步骤： A.设计并制备用于捕获Liddle's相关基因突变的探针。并将这些探针结合在磁 珠、薄膜或者玻片上。探针序列见序列表。 B.将待测基因 DNA样品分别片段化至200-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使 片段两端引入粘性末端。 C.分别加入Illumina公司Nextera? DNA Sample Prep Kit中设计好的一端带有 标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与的一对接头连接，形成新的片段。 D.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对Illumina公司Nextera? Index Kit-PCR primers通用引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR 扩增反应； E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交， 然后经过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。 F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。 G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。 为实现上述技术方案，步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸（DNA)，或是核糖核 酸（RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可以 是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。链霉素磁珠材质是铝镍 钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些 材质。 其中，步骤A所述的捕获探针，包括覆盖以下基因 SCNN1B和SCNN1G全部编码外显 子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为50bp-180bp，最优 为75bp ;片段长度为60bp-200bp，最优为80bp ;片段长度为65bp-220bp，最优为85bp ;片段 长度为70bp-240bp，最优为90bp ;探针之间重叠部分为5-20bp，最优为8bp ;目标区碱基的 探针覆盖度为IX至10X，最优为3X。 本专利技术的主要优点在于： 1.本专利技术可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部Liddle's相关 基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99. 99%。 2.本专利技术的试剂盒可以一次完成1-48个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大 地降低了样品准备的成本。 3.本专利技术的试剂盒可以一次完成1-1152个样品本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测Liddle’s综合征相关基因突变的试剂盒，其包括：捕获目的SCNN1B、SCNN1G基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。
【技术特征摘要】
1. 一种检测Liddle' S综合征相关基因突变的试剂盒，其包括：捕获目的SCNN1B、 SCNN1G基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用 引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP ;高保真聚合酶；链霉素磁珠。2. 根据权利要求1所述一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒，全部探 针在3'采用生物素修饰。3. 根据权利要求1所述一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒这种探 针是寡聚核糖核酸（RNA)，或寡聚脱氧核糖核酸（DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括 生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。4. 根据权利要求1所述一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒的探针 是结合在磁珠上的，或结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。5. 根据权利要求1所述一种检测Liddle' s综合征相关基因突变的试剂盒的探针 针对目标区域以高密度叠瓦式设计，探针序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘哲，
申请(专利权)人：百世诺北京医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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