使用表面涂层对生物物质的捕获、纯化和释放制造技术

本发明专利技术涉及一种用于捕获循环稀有细胞的表面涂层，其包含用以阻止非特异性细胞的结合和血清组分的吸附的抗污组合物；用于结合生物物质如循环肿瘤细胞的生物活性组合物；具有或没有结合所述抗污和生物活性组合物的连接体组合物。本发明专利技术还提供一种用于捕获并纯化生物物质的表面涂层，其包含用以释放非特异性细胞和其它血清组分的释放性组合物；用于结合生物物质如循环肿瘤细胞的生物活性组合物；具有或没有结合所述释放性和生物活性组合物的连接体组合物。本发明专利技术还公开了一种新型的微流体芯片，其具有特定图案化的微结构，以产生流动扰动并提高生物物质的捕获率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用表面涂层对生物物质的捕获、纯化和释放相关申请的交叉引用本申请是2011年6月29日提交的美国专利申请序号61/502,844和2012年3月2日提交的美国专利申请序号61/606,220的正式申请，以上两个申请通过引用整体并入本文。关于在联邦政府资助的研究与开发下进行的专利技术的权利的声明不适用关于“序列表”、表格或光盘提交的计算机程序列表附件表1是EpAb4-1抗体的氨基酸序列。
技术介绍
细胞脱落到循环中是恶性肿瘤的一种固有特性，而这一特性对于癌症患者的诊断、分期、治疗反应和生存期提供了重要的信息。例如，Pantel等人发现血液中的循环肿瘤细胞（CTC）的数目与癌症的攻击性以及治疗的功效相关。（Pantel，K.等人，“Detection,clinicalrelevanceandspecificbiologicalpropertiesofdisseminatingtumorcells”,NatRevCancer,2008，8(5):329-40）。然而，CTC是罕见的细胞，在转移癌症患者的血细胞中只占1/109。这使得CTC的检测和分离在技术上具有挑战性。（见Kahnet等人，BreastCancerResTreat2004,86:237-47）。因此，对于有效地检测和分离CTC，富集过程是必要的。这样的富集过程的一个实例是使用高度过量表达的、对CTC具有高特异性和灵敏性的细胞表面生物标志物，如上皮细胞粘附分子（EpCAM）。唯一获得FDA批准的CTC检测平台—CellsearchSystemTM（Veridex），利用抗-EpCAM抗体涂覆的磁性纳米粒子捕获和富集CTC，接着进行细胞角蛋白免疫染色。另一种可商业获得的CTC检测系统—AdnaTest（AdnaGenAG，德国），采用了类似的免疫磁性方法，这种方法是通过使用抗-EpCAM和黏蛋白1（MUC1）偶联的磁珠。最近，开发了基于抗-EpCAM抗体涂覆的微流体芯片的“CTC芯片”用于CTC检测和富集（Nagrath等人，Nature2007,450:1235-9）。然而，由于抗-EpCAM抗体与血细胞的非特异性结合，上述技术的缺点是纯CTC的检测率低。为了使CTC的检测和分离最大化，降低其它循环血细胞的非特异性结合是必要的。这可以通过用生物惰性材料进行表面修饰来实现。例如，Kaladhar等人观察到了明显更少的循环血细胞（如血小板、白细胞和红细胞）结合到由含磷脂酰胆碱、胆固醇和糖脂的各种脂质组合物的支撑单层修饰的固体基质上（Kaladhar等人，Langmuir2004,20:11115-22和Kaladhar等人,JBiomedMaterResA2006,79A:23-35）。尽管在检测和分离CTC的技术方面取得了进步，但仍然需要更特异的、有效的用于检测、纯化和释放CTC和其它生物物质的方法，以便进行进一步的培养和表征。
技术实现思路
一方面，本专利技术涉及一种用来捕获循环稀有细胞（CRC）的表面涂层。这种表面涂层提高诸如CTC、循环干细胞（例如肿瘤干细胞和骨髓干细胞）、胚胎细胞、细菌、病毒、上皮细胞、内皮细胞等CRC的捕获效率，并且减少非特异性细胞的结合或蛋白质吸附。这种表面涂层包含1）抗污组合物（nonfoulingcomposition），该组合物会减少非特异性血细胞的结合和其它血液组分如蛋白质的吸附；和2）捕获CRC的生物活性组合物。该表面涂层还包含连接到所述抗污组合物和生物活性组合物上的连接体组合物，如图1A所示。另一方面，本专利技术涉及一种用来捕获和释放生物物质的表面涂层。这种表面涂层提高诸如CTC、循环干细胞（例如肿瘤干细胞、肝干细胞和骨髓干细胞）、胚胎细胞、细菌、病毒、上皮细胞、内皮细胞等生物物质的捕获效率，并且增强非特异性细胞或蛋白质从表面涂层上的去除或释放。所述表面涂层包含1）释放性组合物，用于从表面涂层上释放或去除非特异性的血细胞和其它血液组分，如蛋白质；和2）捕获生物物质的生物活性组合物。该表面涂层还包含连接到所述释放性组合物和生物活性组合物上的连接体组合物。本专利技术还涉及一种微流体装置，其具有特定的微结构设计，用以产生血液、体液或生物样品的扰流以提高生物物质的捕获率。本专利技术还涉及一种制造表面涂层的方法，包括：a）形成抗污或释放性组合物；和b）将连接体组合物与来自步骤a）的抗污/释放性组合物和生物活性组合物连接，或c)将来自步骤a）的抗污/释放性组合物与生物活性组合物连接。本专利技术还涉及从表面涂层上捕获和释放生物物质的方法。在表面涂层上的生物物质可通过去除非特异性细胞或蛋白质进行纯化。所捕获的生物物质可通过气泡、紫外线照射等得到释放。本专利技术还涉及使用生物素化的抗-EpCAM抗体——EpAb4-1抗体来捕获CTC。附图说明本专利技术的实施方案可以参照附图加以说明。图1A示意性地显示了包含抗污组合物、连接体组合物和生物活性组合物的表面涂层的实施方案。图1B示意性地显示了循环肿瘤细胞与图1A的表面涂层的结合。图2A到图2F显示了抗污材料的实例的化学结构。图3显示了在抗污组合物和生物活性组合物上的官能团之间的耦合的化学反应。图4A示意性地显示了不使用表面连接体的表面涂层和固体基质的连接。图4B和4C示意性地显示了具有可裂解官能团的连接体组合物。图4D示意性地显示了使用表面连接体的表面涂层和固体基质的连接。图5A和5B示意性地显示了固体基质上的表面涂层的形成。图6A和6B示意性地显示了微流体芯片的组件。图6C示意性地显示了微流体芯片组装件，用以从生物样品中捕获CTC。图7A到7H示意性地显示了固体基质上的微结构的设计。图7I和7J分别显示了各种微结构设计在DMEM溶液和血液中的捕获效率。图8显示了用来释放非特异性细胞和纯化所捕获的生物物质的缓冲液的剪切应力。图9示意性地显示了通过气泡方法释放生物物质。图10A示意性地显示了在固体基质上的含有可裂解连接体组合物的表面涂层。图10B示意性地显示了生物物质从图10A中的表面涂层上的释放。图11显示了表面涂层结构的QCM-D反应。图12显示了向表面涂层添加牛血清白蛋白的QCM-D反应。图13是在缓冲液冲洗之前和之后，表面涂层上的非特异性细胞（顶部图片）和CTC（底部图片）的照片。图14A显示了各种表面涂层的捕获效率和非特异性血细胞结合。图14B是照片图片，其显示了在缓冲液冲洗之前和之后，各种表面涂层的非特异性血细胞结合。图15A到图15C是在缓冲液冲洗纯化之前和之后，表面涂层上的非特异性细胞和生物物质的照片。图16显示了用于从表面涂层上去除HCT116和NIH-3T3细胞群体的不同剪切应力和冲洗时间。图17是通过气泡释放的CTC的照片。图18显示了在第1天、第10天和第14天释放出的CTC的细胞培养物。图19示意性地显示了CTC过滤装置。图20显示了生物素化的OC9801抗体、生物素化的EpAb4-1抗体、生物素化的EpCaM抗体和IgG抗体的CTC结合特异性。专利技术详述本专利技术涉及一种用来有效地捕获循环稀有细胞（CRC）如CTC、循环干细胞（例如肿瘤干细胞和骨髓干细胞）、胚胎细胞、细菌、病毒、上皮细胞、内皮细胞等的表面涂层。在一个实施方案中，用来捕获CRC的表面涂层包含1）抗污组合物，该组合物阻止非本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于捕获循环稀有细胞的表面涂层，所述表面涂层包含：a）抗污组合物；和b）生物活性组合物，其对所述循环稀有细胞具有选择性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.29 US 61/502,844;2012.03.02 US 61/606,2201.一种用于捕获循环稀有细胞的表面涂层，所述表面涂层包含：a)包含脂质的抗污组合物；和b)包含结合部分的生物活性组合物，所述结合部分对所述循环稀有细胞具有选择性，其中所述生物活性组合物偶联于所述抗污组合物，和其中所述结合部分包含生物素化的EpAb4-1抗体，且其中所述抗体包含：(a)重链序列，其中所述重链序列是SEQIDNO:1；和(b)轻链序列，其中所述轻链序列是SEQIDNO:2。2.根据权利要求1所述的表面涂层，其中所述抗污组合物通过相互作用与所述生物活性组合物连接，该相互作用包括静电相互作用、亲水-亲水相互作用、极性-极性相互作用、互补DNA结合、磁力或其组合。3.根据权利要求1所述的表面涂层，还包含连接体组合物，该连接体组合物将所述抗污组合物连接到所述生物活性组合物上，并且包含能够共价、非共价或共价和非共价组合地连接到所述抗污组合物上以及连接到所述生物活性组合物上的官能团。4.根据权利要求3所述的表面涂层，其中所述连接体组合物在共价连接之前包含选自羟基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、环氧基或环氧乙烷基团、肼基和巯基的官能团。5.根据权利要求3所述的表面涂层，其中所述连接体组合物在非共价连接之前包含作为结合对的第一成员的官能团，该官能团选自生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、DNA、RNA、配体、受体、抗原、抗体和荷电基团，它们中的每一个被选为与存在于所述抗污组合物或生物活性组合物上的结合对的第二成员结合。6.根据权利要求3所述的表面涂层，其中所述连接体组合物包含可裂解官能团。7.根据权利要求1所述的表面涂层，其中相对于不含抗污组合物的组合物，所述抗污组合物减少了非特异性生物物质的结合，并且所述抗污组合物选自：脂质或脂质混合物、多肽、聚电解质多层、聚乙烯醇、PEG、水凝胶聚合物、细胞外基质蛋白、聚合物刷、两性离子材料、碳水化合物、小有机化合物及其组合。8.根据权利要求7所述的表面涂层，其中所述脂质或脂质混合物是脂质层。9.根据权利要求7所述的表面涂层，其中所述PEG具有100至100,000的分子量。10.根据权利要求7所述的表面涂层，其中所述聚电解质多层包含聚-L-赖氨酸/聚-L-谷氨酸，或聚-L-赖氨酸/聚-L-天冬氨酸。11.根据权利要求7所述的表面涂层，其中所述聚合物刷包括[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵/2-羧基丙烯酸乙酯)共聚物。12.根据权利要求7所述的表面涂层，其中所述两性离子材料是聚(磺基甜菜碱)(pSB)和聚(羧基甜菜碱)。13.根据权利要求1所述的表面涂层，其中所述抗污组合物在共价连接之前包含选自羟基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、环氧基或环氧乙烷基团、肼基和巯基的官能团。14.根据权利要求1或3所述的表面涂层，其中所述抗污组合物在非共价连接之前包含作为结合对的第一成员的官能团，该官能团选自生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、DNA、RNA、配体、受体、抗原、抗体和荷电基团，它们中的每一个被选为与存在于所述连接体组合物或生物活性组合物上的结合对的第二成员结合。15.根据权利要求1所述的表面涂层，其中所述生物活性组合物在共价连接之前包含选自羟基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、环氧基或环氧乙烷基团、肼基和巯基的官能团。16.根据权利要求1或3所述的表面涂层，其中所述生物活性组合物在非共价连接之前包含作为结合对的第一成员的官能团，该官能团选自生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、DNA、RNA、配体、受体、抗原、抗体和荷电基团，它们中的每一个被选为与存在于所述连接体组合物或抗污组合物上的结合对的第二成员结合。17.根据权利要求1所述的表面涂层，其中所述生物活性组合物具有选自合成聚合物、分子印迹聚合物、细胞外基质蛋白、结合受体、DNA、RNA、抗体、抗原、表面标记物和适体的结合部分。18.根据权利要求17所述的表面涂层，其中所述结合部分是抗-EpCAM膜蛋白抗体或抗-HER2。19.根据权利要求18所述的表面涂层，其中所述抗-EpCAM膜蛋白抗体是EpAb4-1。20.根据权利要求1或3所述的表面涂层，还包含固体基质。21.根据权利要求20所述的表面涂层，其中所述固体基质通过下列相互作用之一连接到表面涂层上：共价键合、氢键键合、静电相互作用、亲水-亲水相互作用、极性-极性相互作用、互补DNA结合、磁力或其组合。22.根据权利要求20所述的表面涂层，还包含将所述表面涂层连接到所述固体基质上的表面连接体。23.根据权利要求22所述的表面涂层，其中所述表面连接体包含可裂解官能团。24.根据权利要求22所述的表面涂层，其中所述表面连接体在共价连接之前包含选自羟基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、环氧基或环氧乙烷基团、肼基和巯基的官能团。25.根据权利要求22所述的表面涂层，其中所述表面连接体在非共价连接之前包含作为结合对的第一成员的官能团，该官能团选自生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、DNA、RNA、配体、受体、抗原、抗体和荷电基团，它们中的每一个被选为与存在于所述固体基质或抗污组合物上的结合对的第二成员结合。26.一种用于捕获和纯化生物物质的表面涂层，所述表面涂层包含：a)包含抗污组合物的释放性组合物；和b)包含结合部分的生物活性组合物，所述结合部分对所述生物物质具有选择性，其中所述生物活性组合物偶联于所述抗污组合物，和其中所述结合部分包含生物素化的EpAb4-1抗体，且其中所述抗体包含：(a)重链序列，其中所述重链序列是SEQIDNO:1；和(b)轻链序列，其中所述轻链序列是SEQIDNO:2。27.根据权利要求26所述的表面涂层，其中所述释放性组合物通过相互作用连接到所述生物活性组合物上，该相互作用包括静电相互作用、亲水-亲水相互作用、极性-极性相互作用、互补DNA结合、磁力或其组合。28.根据权利要求26所述的表面涂层，还包含连接体组合物，该连接体组合物将所述抗污组合物连接到所述生物活性组合物上，并且包含能够共价、非共价或共价和非共价组合地连接到所述抗污组合物上以及连接到所述生物活性组合物上的官能团。29.根据权利要求28所述的表面涂层，其中所述连接体组合物包含选自羟基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、环氧基或环氧乙烷基团、肼基和巯基的官能团。30.根据权利要求28所述的表面涂层，其中所述连接体组合物在非共价连接之前包含作为结合对的第一成员的官能团，该官能团选自生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、DNA、RNA、配体、受体、抗原、抗体和荷电基团，它们中的每一个被选为与存在于所述生物活性或释放性组合物上的结合对的第二成员结合。31.根据权利要求28所述的表面涂层，其中所述连接体组合物包含可裂解官能团。32.根据权利要求26所述的表面涂层，其中相对于不含释放性组合物的表面涂层，所述释放性组合物增强了从其表面除去非特异性细胞和血液组分，并且所述释放性组合物选自：脂质或脂质混合物、多肽、聚电解质多层、聚乙烯醇、PEG、水凝胶聚合物、细胞外基质蛋白、聚合物刷、两性离子材料、碳水化合物、小有机化合物及其组合。33.根据权利要求32所述的表面涂层，其中所述脂质或脂质混合物是支撑的脂质层。34.根据权利要求32所述的表面涂层，其中所述PEG具有100至100,000的分子量。35.根据权利要求32所述的表面涂层，其中所述聚电解质多层包含聚-L-赖氨酸/聚-L-谷氨酸或聚-L-赖...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑛芝，吴汉忠，曾博元，
申请(专利权)人：中央研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71