本发明专利技术公开了一种电致化学发光成像装置，包括物镜、光传输通道、单光子检测电子倍增CCD和电致化学发光发生器，所述电致化学发光发生器包括ITO电极、银电极和电压发生器，其中，所述物镜、光传输通道和单光子检测电子倍增CCD依次连接；所述ITO电极与电压发生器相连的正极连接，所述银电极与电压发生器的负极连接。本发明专利技术还提出了一种上述电致化学发光成像装置在可视化检测双氧水中的应用以及该装置在可视化检测单细胞表面外泄双氧水和可视化检测细胞表面分子上的应用。本发明专利技术的电致化学发光成像装置组成简单，可进行平行快速检测，检测通量大，操作简便，发光效率高。
【技术实现步骤摘要】
一种电致化学发光成像装置及其应用
本专利技术属于生物化工
，具体地涉及一种电致化学发光成像装置及其应用。
技术介绍
应用电化学技术对单细胞进行成像研究可以得到细胞表面化学组分和局部活性等重要生物信息，目前最通用的显微仪器为电化学扫描显微镜。这个显微镜是利用一根微电极扫描单一活细胞的表面来检测具有电活性的化学物种。通过降低电极尺寸至纳米级别可使得电化学扫描显微镜的空间分辨率达到纳米级别。该技术的缺陷在于:每一个细胞表面必须单一独立检测，因此检测的通量被严重限制。作为除了电化学扫描显微镜的另一种选择，近期发展的基于表面等离子共振的电化学成像技术利用了局部的电化学信号和表面等离子共振信号之间的关系来进行单细胞成像。虽然这种新技术通过对多细胞的平行检测提高了检测通量，但是表面等离子共振技术由于自身检测灵敏度差，因此很难对单细胞中外泄的生物分子或者细胞表面低丰度分子进行检测。电致化学发光是一种高灵敏的电化学方法。它利用电化学反应激发的物质从激发态回到基态的同时，发射光来实现对分子的检测。鉴于整个电极表面生物分子产生的光都会被单光子检测电子倍增电子耦合元件(CCD)接收，因此基于电致化学发光的成像技术具有高通量和高灵敏度的优势，具备目前两种单细胞用电化学成像技术的优点。现有电致化学发光成像已经用于对电极表面的模糊指纹和蛋白质层的成像。最新技术可对微球表面的抗原成像。该技术通过引入浓度高达毫摩尔级别的共反应物，就可以在0.4微米的区域中产生能够检测到的光信号，进而将空间分辨率推到亚微米级别。虽然电致化学发光成像技术显示具有对细胞表面抗原成像的潜力，我们在将此项技术用于对单细胞分子外泄过程进行成像时受到了挑战。因为释放出的分子浓度非常低，通常是在微摩级别。虽然在鲁米诺存在的情况下，这些释放出的分子通过其氧化酶而转变成可电致化学发光的双氧水，但要实现在亚微米的区域中，且加上秒级别的采样时间(时间分辨率)范围内，对如此低浓度的生物分子获取可检测的光信号，还是不太可能的。
技术实现思路
专利技术目的:为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出一种构造简单，收光效率高，可实现对单细胞中外泄的生物分子或者细胞表面低丰度分子进行检测的电致化学发光成像装置及其应用。
技术实现思路
:为实现上述技术目的，本专利技术提出一种电致化学发光成像装置，包括物镜、光传输通道、单光子检测电子倍增CCD和电致化学发光发生器，所述电致化学发光发生器包括ITO电极银电极和电压发生器，其中，所述物镜、光传输通道和单光子检测电子倍增CCD依次连接；所述ITO电极与电压发生器的正极相连，所述银电极和电压发生器的负极相连。其中，所述物镜为5倍镜、10倍镜、20倍镜、40倍镜和100倍镜中的任意一种，物镜的N.A.越大越好。优选地，所述物镜为N.A.为0.50的20倍镜。根据对空间分辨率的要求选择合适的物镜及其N.A值。本专利技术还提出了上述的电致化学发光成像装置在可视化检测双氧水中的应用。具体地，所述应用包括如下步骤:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将发光试剂和双氧水加入到O型圈内，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果O其中，所述的发光试剂为所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺、异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为浓度为100 μ M?500 μ Μ，优选地发光试剂为LO12，发光试剂的用量为100 μ M?500 μ Μ，优选地为200 μ M0其中，所述双氧水的检测范围为10?200 μ Μ。优选地，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:1.0±0.1V的正电压下2±ls ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。更为优选地，所述周期性的发光电压-恢复电压的一个周期为:发光电压:1.0V的正电压下2s ;恢复电压:-1.0V的负电压下0.5s。本专利技术还提出了上述装置在可视化检测单细胞表面外泄双氧水中的应用。具体地，所述可视化检测单细胞表面外泄双氧水的步骤包括:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将细胞在溶液室中培养，向溶液室中加入发光试剂，然后加入PMA刺激细胞内的NADPA氧化酶使细胞表面产生双氧水，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果。其中，所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4_氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺和异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为100 μ M?500 μ Mo优选地发光试剂为L012，发光试剂的用量为ΙΟΟμΜ?500μΜ，优选地为200 μ Μ。优选地，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:1.0±0.1V的正电压下2±ls ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。更为优选地，所述周期性的发光电压-恢复电压的一个周期为:发光电压:1.0V的正电压下2s ;恢复电压:-1.0V的负电压下0.5s。本专利技术还提出了上述装置在可视化检测细胞表面分子上的应用。具体地，包括如下步骤:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将细胞在溶液室中培养，向溶液室中加入发光试剂，利用细胞表面的待测分子对应的氧化酶将所述待测分子转化为双氧水，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果。其中，所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4_氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺和异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为100 μ M?500 μ Mo优选地发光试剂为L012，发光试剂的用量为ΙΟΟμΜ?500μΜ，优选地为200μΜ。优选地，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:1.0±0.1V的正电压下2±ls ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。更为优选地，所述周期性的发光电压-恢复电压的一个周期为:发光电压:1.0V的正电压下2s ;恢复电压:-1.0V的负电压下0.5s。有益效果:与现有技术相比，本专利技术有如下优点:(I)本专利技术的电致化学发光成像装置组成简单，收光率高，可进行平行快速检测，且检测的空间分辨率可以通过物镜倍率和单光子检测电子倍增CCD进行调节，并通过电位调节来促进发光效率，获取可检测的信号，同时，可以直接将培养细胞的ITO电极放置于显微镜平台上检测，不用进一步修饰电极，因此可以方便的将本电致化学发光发光分析技术用于生物研究，且可以同时获得ITO表面所有细胞的发光信息从而加大了检测的通量，对于单细胞检测具有重要意义。(2)通过在电致化学发光检测的过程中加载周期性的发光电压和恢复电压，可以避免在电极上持续施加高压会导致电极本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种电致化学发光成像装置，其特征在于，包括物镜、光传输通道、单光子检测电子倍增CCD和电致化学发光发生器，所述电致化学发光发生器包括ITO电极、银电极和电压发生器，其中，所述物镜、光传输通道和单光子检测电子倍增CCD依次连接；所述ITO电极与电压发生器的正极相连，银电极和电压发生器的负极相连。
【技术特征摘要】
1.一种电致化学发光成像装置，其特征在于，包括物镜、光传输通道、单光子检测电子倍增CCD和电致化学发光发生器，所述电致化学发光发生器包括ITO电极、银电极和电压发生器，其中，所述物镜、光传输通道和单光子检测电子倍增CXD依次连接；所述ITO电极与电压发生器的正极相连，银电极和电压发生器的负极相连。2.权利要求1所述的电致化学发光成像装置在可视化检测双氧水中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤:将发光试剂和双氧水加入到O型圈内，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺和异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为ΙΟΟμΜ?500μΜ。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述双氧水的检测范围为10?200μ Μ。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:1.0±0.1V的正电压下2± Is ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。7.权利要求1所述的装置在可视化检测单细胞表面外泄双氧水中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将细胞在溶液室中培养，向溶液室中加入发光试剂，然后加入PMA刺激细胞内的NADPA氧化酶使细胞表面产生双氧水，在单光子检测电子倍...
【专利技术属性】
技术研发人员：方丹君，江德臣，周俊宇，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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