本发明专利技术提供了一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法利用，鲁米诺电致化学发光被首次应用于单细胞内生物分子(如葡萄糖)的检测。在检测过程中，单个细胞被直接定位在单个细胞大小的微洞电极；加入含有鲁米诺、曲通100和葡萄糖氧化酶的混合溶液后，曲通100可以破坏细胞膜，释放细胞内的葡萄糖到微洞中，和洞内的葡萄糖氧化酶反应生成过氧化氢；过氧化氢与鲁米诺反应在正电位下产生光信号。这种新发明专利技术的电化学发光测定方法将有可能被应用于对单细胞中更多的细胞内分子进行快速分析，以阐明细胞间的异质性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物仪器检测领域，具体涉及一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法。
技术介绍
电化学发光是物质发生电化学反应后形成的激发态物质跃迁、释放能量并诱导光学辐射的一个过程。与化学发光和荧光等检测系统相比，电化学发光结合了电化学和光学方法，具有许多独特的优点。具体而言，与化学发光相比，电化学发光更可控，对于发射光的选择性分离也更好；与荧光相比，电化学发光不存在激发光，这使得背景光的干扰被降到最低，从而获得较高的灵敏度。因此，在生化分析中，电化学发光是一种强有力的分析工具。众所周知，鲁米诺-过氧化氢体系能产生较强的电化学发光。在此过程中，鲁米诺和过氧化氢发生电化学反应产生对二氮烯和其他含氧化物，并进一步经过高能电子转移反应，生成3-氨基邻苯二甲酸，进而发射光信号。考虑到相应的氧化酶与目标分子反应会产生过氧化氢，我们在先前的工作中引入胆固醇氧化酶，利用鲁米诺电化学发光，对胆固醇在单个细胞细胞膜中的含量进行分析。为了提高分析速度，我们意识到可以使用电化学发光成像进行平行测定，即使用电子倍增CCD(EM CCD)把多个细胞表面的过氧化氢或者活性胆固醇的发光情况记录在一张图像中。虽然我们的工作已经证明了电化学发光是单细胞分析的有效方法，然而这个方法受限于分析细胞表面分子。因为细胞内小分子波动与细胞活性相关联，对于生物学研究而言是相当重要，因此如能利用电化学发光对细胞内分子进行，将具有重要的生物学意义。
技术实现思路
专利技术目的：为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法。技术方案：为实现上述技术目的，本专利技术的电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法，待检测的成分在对应的氧化酶的作用下催化产生双氧水，其特征在于，包括如下步骤：(1)提供表面具有若干微孔的氧化铟锡电极表面作为微电极，将该微电极作为工作电极与电化学工作站连接，银/氯化银和铂电极分别作为参比电极和辅助电极，通过电沉积将金纳米颗粒沉积到微电极的微孔表面；(2)以含有200-500μM L012的10-20mM PBS的混合溶液作为氧化铟锡
片发光成像的溶液加入到微孔中，将待分析的单个细胞设置于微孔内，加入表面活性剂和待分析成分对应的氧化酶，使用电压发生器施加正负交替的电压在电极上诱使发光，然后使用电化学发光成像装置连续采集曝光时间为60s的两张照片，来收集来自细胞的发光信号；(3)使用Image J软件计算两个图像中发光强度的差异，同时为了校准来自ITO微孔处的发光差异，将50-100μM过氧化氢水溶液引入微孔内并对微孔发光的光强进行采集，在微电极的微孔内的单个细胞的发光强度和加入的过氧化氢收集到的发光强度的比率作为信号被用于细胞内成分的分析检测。其中，所述的待检测成分可以为葡萄糖、乳酸或胆固醇中的任意一种或其他在氧化酶作用下可以产生双氧水的物质。优选地，步骤(1)中，所谓微电极表面设置有64-256个用于容纳单个细胞的微孔。所述金纳米粒子的电沉积通过在含有1-5mM HAuCl4的0.1M HCl溶液中，循环扫描得到，其中，电势由-0.2V到0.55V，循环扫描400-800s。所述电压发生器施加的正负交替的电压为1V，2s和-1V，0.5s。步骤(2)中，所述的表面活性剂为0.1-0.5％的Triton X-100，所述的葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-0.5U/mL。在本文中，电化学发光方法被首次尝试用来分析单细胞中的物质，细胞内的葡萄糖被选为模型分子。如图1所示，单个细胞被置于氧化铟锡电极表面的微孔上。加入的表面活性剂，如triton X-100，可以溶解细胞膜，使得细胞内葡萄糖被释放，与溶液中的葡萄糖氧化酶进行反应；生成的过氧化氢在正电压的刺激下，可以诱导发光，以实现细胞内葡萄糖的分析。微孔结构的设计不仅可以保留单个细胞，也可以降低过氧化氢从氧化铟锡电极表面扩散到微孔的过程，从而可以在一段时间内应该使用鲁米诺发光成像系统持续地收集光信号，实现单细胞的快速检测。本专利技术实现了可以同时检测多个细胞，增加了检测通量，并通过对微孔镀金修饰，增强了发光信号，从而实现微洞的电致发光成像。附图说明图1电致化学发光成像装置和单细胞细胞内葡萄糖的检测技术示意图；图2微孔中电沉积Au NPs(实线)和未沉积Au NPs(虚线)的ITO区域的特征发光曲线。光电倍增管(PMT)电压为800V；图3氧化铟锡片上制备的微洞镀金后在含有200μM L012的10mM PBS中电致化学发光照片。(A)明场照片；(B-H)5，10，20，50，100，200，500μM双氧水加入前后的发光差异照片；(I)发光差异强度和双氧水浓度的相关性。误差棒代表来自64个微洞的发光强度的标准偏差；图4(A)单个细胞位于微洞中的明场照片；(B)加入葡萄糖氧化酶和曲通100后在第一个60s采集的发光照片；(C)第二个60s采集的发光照片；(D)这两张照片的发光差异；图5(A)微洞中单个饥饿细胞的明场图像；(B)只加入曲通100后，第一个个60s内收集到的发光图像；(C)第二个60s内收集的发光图像；(D)两张图像之间的发光差异；图6(A)微孔中单个饥饿细胞的明场图像；(B)加入葡萄糖氧化酶/曲通100后首个60s内收集到的发光图像；(C)第二个60s内收集的发光图像；(D)两张图像之间的发光差异；图7(A)128个正常细胞的发光比率；(B)128个饥饿处理4h的细胞.每个点代表一个细胞。具体实施方式下面通过具体的实例详细说明本专利技术的技术方案。化学试剂和细胞培养：光致抗蚀剂SU-8和显影剂是从Microchem公司(Newton，MA)购置的。化合物8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3，4-d]哒嗪-1，4(2H，3H)-二酮(L012)从光化工美国公司购买得到。其他所有化学试剂都是从西格玛奥德里奇公司购置的。实验中采用电阻率为18.2MΩ/cm的纯水。缓冲溶液均经过消毒处理。Hela细胞来自于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所(中国上海)。Hela细胞在加有10％(v/v)牛胎血清(FBS)和1％(v/v)抗菌素(青霉素/链霉素)的DEME高糖培养基中培养。细胞培养过程在37℃恒温，含5％CO2的湿润环境中进行。本实例提供了一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法，包括如下步骤：(1)金纳米颗粒(Au-NPs)在氧化铟锡微洞电极表面的沉积：在氧化铟锡表面上制备获得了直径为30微米的64个微洞，用于容纳单个细胞。简要来说，在氧化铟锡片(边长2cm)上旋转镀上一层厚度约30μm的SU-8光刻胶，65℃
软烤3分钟，95℃软烤7分钟后，通过氧化铁掩模片和光刻系统对氧化铟锡玻璃上的光刻胶紫外照射20s；接着65℃软烤1分钟，95℃软烤3分钟，未聚合的光刻胶通过SU-8显影剂进行移除；暴露出来的ITO区域就可以导电，得到一个有64个孔径为30μm的微孔电极。接下来，将具有微洞的玻片在120℃下硬烤30min；并将O型圈粘附在氧化铟锡片上，以形成细胞室。将该微电极作为工作电极与电化学工作站(CHI 630E，辰华公司)连接，银/氯化银和铂电极分别作为参比电极和辅助电极。金纳本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法，待检测的成分在对应的氧化酶的作用下催化产生双氧水，其特征在于，包括如下步骤：(1)提供表面具有若干微孔的氧化铟锡电极表面作为微电极，将该微电极作为工作电极与电化学工作站连接，银/氯化银和铂电极分别作为参比电极和辅助电极，通过电沉积将金纳米颗粒沉积到微电极的微孔表面；(2)以含有200‑500μM L012的10‑20mM PBS的混合溶液作为氧化铟锡片发光成像的溶液加入到微孔中，将待分析的单个细胞设置于微孔内，加入表面活性剂和待分析成分对应的氧化酶，使用电压发生器施加正负交替的电压在电极上诱使发光，然后使用电化学发光成像装置连续采集曝光时间为60s的两张照片，来收集来自细胞的发光信号；(3)使用Image J软件计算两个图像中发光强度的差异，同时为了校准来自ITO微孔处的发光差异，将50‑100μM过氧化氢水溶液引入微孔内并对微孔发光的光强进行采集，在微电极的微孔内的单个细胞的发光强度和加入的过氧化氢收集到的发光强度的比率作为信号被用于细胞内成分的分析检测。
【技术特征摘要】
1.一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法，待检测的成分在对应的氧化酶的作用下催化产生双氧水，其特征在于，包括如下步骤：(1)提供表面具有若干微孔的氧化铟锡电极表面作为微电极，将该微电极作为工作电极与电化学工作站连接，银/氯化银和铂电极分别作为参比电极和辅助电极，通过电沉积将金纳米颗粒沉积到微电极的微孔表面；(2)以含有200-500μM L012的10-20mM PBS的混合溶液作为氧化铟锡片发光成像的溶液加入到微孔中，将待分析的单个细胞设置于微孔内，加入表面活性剂和待分析成分对应的氧化酶，使用电压发生器施加正负交替的电压在电极上诱使发光，然后使用电化学发光成像装置连续采集曝光时间为60s的两张照片，来收集来自细胞的发光信号；(3)使用Image J软件计算两个图像中发光强度的差异，同时为了校准来自ITO微孔处的发光差异，将50-100μM过氧化氢水溶液引入微孔内并对微孔发光的光强进行采集，...
【专利技术属性】
技术研发人员：江德臣，方丹君，徐晶晶，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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