利用分子梳理监测经修饰的核酸酶诱导的基因编辑事件的方法技术

用于以高分辨率检测和表征由经修饰的核酸酶诱导的大基因组重排和用于使用分子梳理定量由经修饰的核酸酶诱导的大基因组或基因重排的频率的方法。

A Method for Monitoring Gene Editing Events Induced by Modified Nucleases by Molecular Carding

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用分子梳理监测经修饰的核酸酶诱导的基因编辑事件的方法专利技术背景专利
本专利技术涉及使用分子梳理(molecularcombing)以高分辨率检测和表征由经修饰的核酸酶诱导的大基因组重排的方法。本专利技术还涉及使用分子梳理定量由经修饰的核酸酶诱导的大基因组重排的频率的方法。包含适用于本专利技术的装置的相关技术的描述分子梳理分子梳理技术已公开于各种专利和科学出版物中，例如U.S.6,303,296,WO9818959,WO0073503,U.S.2006/257910,U.S.2004/033510,U.S.6,130,044,U.S.6,225,055,U.S.6,054,327,WO2008/028931,WO2010/035140以及(Michalet,Ekong等1997；Herrick,Michalet等2000；Herrick,Stanislawski等2000；Gad,Aurias等2001；Gad,Caux-Moncoutier等2002；Gad,Klinger等2002；Herrick,Jun等2002；Pasero,Bensimon等2002；LebofskyandBensimon2003；Jun,Herrick等2004；Caburet,Conti等2005；Herrick,Conti等2005；LebofskyandBensimon2005；Lebofsky,Heilig等2006；Patel,Arcangioli等2006；Rao,Conti等2007；SchurraandBensimon2009；Nguyen,Walrafen等2011；Cheeseman,Rouleau等2012；Mahiet,Ergani等2012；Tessereau,Buisson等2013；Cheeseman,Ropars等2014；Tessereau,Lesecque等2014；Vasale,Boyar等2015)中。这些参考文献的技术，特别是那些属于或涉及分子梳理的技术，在此通过引用并入上述出版物。Bensimon等的美国专利第6,303,296号公开了DNA拉伸方法(DNAstretchingprocedure)，Lebofsky等的WO2008/028931也公开了分子梳理方法。拉伸从任何来源(从病毒、细菌到人至植物......)提取的核酸，以线性和平行链形式提供固定的核酸，并且优选在适当的表面(例如，经表面处理的载玻片)上用受控的拉伸因子进行。拉伸后，有可能与例如可通过荧光显微镜检查(Lebofsky,Heilig等，2006)检测的序列特异性探针杂交。因此，可以在单个分子水平上直接显现特定序列。荧光信号的长度和/或其数量以及其在载玻片上的间距提供了探针尺寸和相对间距的直接读取。分子梳理是直接显现单个核酸分子的技术，并且具有许多DNA结构的应用，诸如物理作图(Michalet,Ekong等1997；Tessereau,Buisson等2013；Cheeseman,Ropars等2014)和检测重排，包括如参与结节性硬化症的Ca2+激活的中性蛋白酶3基因(Michalet,Ekong等1997)和赋予对遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征的易感性的BRCA1和BRCA2基因(Gad,Aurias等2001；Gad,Caux-Moncoutier等2002；Gad,Klinger等2002；Gad,Bieche等2003；Cheeseman,Rouleau等2012)中的缺失和扩增。WO2014140788A1和WO2014140789A1公开了分别用于检测BRCA1基因座中序列的扩增和检测重排基因组序列中的断裂点的方法。WO2013064895A1公开了使用分子梳理以高分辨率检测BRCA1和BRCA2基因中的基因组重排，以及确定对与这些重排相关的疾病或病症的易感性(包括对卵巢癌或乳腺癌的易感性)。分子梳理还已成功地确定了例如21三体中的基因拷贝数(Herrick,Michalet等，2000)，阐明了重复区域诸如人核糖体DNA(Caburet,Conti等2005)、D4Z4(Nguyen,Walrafen等人2011)和RNU2阵列(Tessereau,Buisson等2013；Tessereau,Lesecque等2014；Tessereau,Leone等2015)的组织，以及检测外源DNA的整合诸如病毒的整合(Herrick,Conti等2005；Conti,Herrick等2007)。WO2010/035140A1公开了基于核酸的拉伸和分子梳理分析第4号和第10号人染色体上的D4Z4串联重复阵列的方法。分子梳理也用于表征DNA复制(Herrick,Stanislawski等2000；Herrick,Jun等2002；Lebofsky和Bensimon2003；Lebofsky和Bensimon2005；Lebofsky,Heilig等2006；Bailis,Luche等2008；Daboussi,Courbet等2008；Dorn,Chastain等2009；Schurra和Bensimon2009)、DNA/蛋白质相互作用(Herrick和Bensimon1999)和转录(Gueroui，Place等人2002)的功能研究。下面引用的专利描述了各种分子梳理方法和用于配置针对特定目的定制的分子梳理方法的各个步骤。基于本公开，本领域技术人员可以调整这些方法或其各个步骤以检测、定量或以其他方式表征通过CRISPR-Cas9、其他基于CRISPR的方法或其他基因组或基因编辑方法进行的基因组或基因编辑事件。来自美国专利第6,303,296号的分子梳理的一个实例包括将核酸在支持物的表面S上对齐，其中该方法包括：(a)提供具有表面S的支持物；(b)使表面S与核酸接触；(c)将核酸锚定至表面S；(d)使表面S与第一溶剂A接触；(e)使第一溶剂A与介质B接触以形成A/B界面，其中所述介质B是气体或第二溶剂；(f)形成由第一溶剂A、表面S和介质B之间的接触产生的三线S/A/B(弯液面(meniscus))；(g)移动弯液面以使核酸在表面上对齐。基于美国专利第7,985,542号的公开内容的另一个实例包括检测待测大分子上存在至少一个目标结构域的方法，其包括：a)确定目标结构域上的至少三个靶区域，b)获得至少三个探针的相应标记组，每个探针靶向所述靶区域之一，选择与另外的探针相比的一个探针的位置，所述位置形成至少一组至少两个不同代码之间选择的至少两个代码的序列，所述代码序列特异于所述结构域并且是待测大分子上的所述目标结构域的特定标签特征(specificsignature)；c)铺展大分子并将探针结合至大分子上，其中铺展步骤发生在结合步骤之前或之后，d)读取每个标记探针给出的信号，每个信号与所述一个探针的标记相关联，e)将所述信号转换成从连续探针之间的间隙大小建立的代码序列，f)在所述序列中检测到目标结构域的代码序列表示在待测大分子上存在所述目标结构域，相反地，未检测到目标结构域的代码序列或代码序列的一部分表示在待测大分子上不存在所述结构域或所述目标结构域的一部分。基于美国专利第7,732,143号的公开内容的分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测、表征、定量或确定基因或基因组编辑方法或事件的效率的方法，其包括：编辑基因或基因组中的靶核酸以及使用分子梳理检测或定量所述编辑的靶核酸中的至少一种遗传修饰、缺失、重复、扩增、易位、插入或倒位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.15 US 62/422,3411.一种用于检测、表征、定量或确定基因或基因组编辑方法或事件的效率的方法，其包括：编辑基因或基因组中的靶核酸以及使用分子梳理检测或定量所述编辑的靶核酸中的至少一种遗传修饰、缺失、重复、扩增、易位、插入或倒位。2.权利要求1的方法，其中所述编辑包括所述靶核酸中双链断裂中的非同源末端连接(NHEJ)。3.权利要求1的方法，其中所述编辑包括所述靶核酸中的同源重组，其包括等位基因同源重组、基因转换、非等位基因同源重组(NAHR)、断裂诱导的复制(BIR)或单链退火(SSA)中的至少一种。4.权利要求1的方法，其中所述编辑方法包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与锌指核酸酶接触。5.权利要求1的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与至少一种TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)接触。6.权利要求1的方法，其中所述编辑包括激活内源细胞修复机制以及使所述一种或多种靶核酸与至少一种大范围核酸酶接触。7.权利要求1的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与LAGLIDADG(SEQ.IDNO:1)家族的至少一种大范围核酸酶接触。8.权利要求1的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与至少一种I-CreI或I-SceI大范围核酸酶接触。9.权利要求1的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与CRISPR/Cas9系统或CRISPR/Cas9变体系统接触。10.权利要求1的方法，其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与I型CRISPR/Cas9系统接触；其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与II型CRISPR/Cas9系统接触；其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与III型CRISPR/Cas9系统接触；其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与IV型CRISPR/Cas9系统的接触；其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与V型CRISPR/Cas9系统接触；或其中所述编辑包括激活内源性细胞修复机制以及使所述靶核酸与VI型CRISPR/Cas9系统接触。11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述编辑产生敲除基因的核酸重排。12.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述编辑...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·巴拉多，A·本西蒙，L·卡瓦雷克，
申请(专利权)人：基因组影像公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR