端粒的物理表征制造技术

本发明专利技术，称为端粒的物理表征(PCT)，为端粒序列的可视化、表征和测量提供了一种有利、准确和方便的新方法。该方法使用探针和染料来创建物理图像的模式，对图像进行分类，并确定端粒序列的长度。PCT使人们更深入地了解以全基因组的方式或以染色体特异性的方式发生的端粒修饰。粒修饰。粒修饰。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】端粒的物理表征
[0001]本专利或申请文件至少包含一张彩色绘图。
[0002]参考序列表
[0003]根据37 CFR
§
1.52(e)(5)，本说明书参考了序列表(以电子方式提交的名为“540058US_ST25.txt”的.txt文件)。.txt文件于2021年11月17日生成，大小为228,340字节。序列表的全部内容通过引用并入本文。
[0004]相关申请的交叉引用
[0005]本申请要求于2020年11月25日提交的美国第63/118,314号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术介绍

[0006]专利
本专利技术属于分子遗传学和医学领域，涉及染色体端粒的准确深入表征。
[0007]相关技术的描述。端粒是脊椎动物非线性染色体末端的重复核苷酸序列区域。在人类和其他脊椎动物中，端粒通常包含重复的非编码六核苷酸(TTAGGG)n1。人类端粒通常跨越5
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15kb的多核苷酸序列，其长度因个体的年龄以及组织和细胞类型而异。
[0008]在染色体复制过程中，复制DNA的酶无法继续复制到染色体末端，因此在每次复制中，染色体末端都会缩短(这是因为冈崎片段的合成需要RNA引物提前附着在滞后链上)。端粒是染色体末端的一次性缓冲物，在细胞分裂过程中被截短；端粒的存在保护染色体上在其之前的基因不被截短。端粒本身受到端粒蛋白复合物(shelterin)以及端粒DNA编码的RNA(TERRA)的保护。然而，随着时间的推移，由于每次细胞分裂，端粒末端都会变短。因此，端粒的长度会随着个体年龄的增长而缩短，例如，平均从出生时的约11kb缩短到老年时的小于4kb。
[0009]端粒通过与shelterin蛋白结合并形成称为T环(T
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loop)的特殊端粒结构来保护染色体末端不被识别为DNA双链断裂。然而，在每次细胞分裂过程中，端粒很容易因半保留的DNA复制而逐渐缩短。端粒极短的细胞会衰老并发生凋亡。
[0010]端粒长度的缩短与许多年龄相关疾病有关，包括关节炎、糖尿病、不孕不育症、心血管和神经退行性疾病2。罕见的综合征，例如肺纤维化、骨髓衰竭、再生障碍性贫血和急性骨髓性白血病等，也与端粒长度严重缩短有关3。与端粒缩短相关的问题相反，癌症或肿瘤细胞(以及胚胎干细胞)通常会维持或增加端粒长度，从而克服衰老或细胞凋亡而永生。
[0011]鉴于端粒长度和其他特征对健康和疾病的重要性，端粒长度和特征的稳健、准确和可重复的测量对于预测人类和其他动物物种中某些遗传和年龄相关疾病的发作可能至关重要。
[0012]一些传统方法(每种方法都有其问题或局限性)可用于对端粒长度进行评分，包括TeSLA、STELA、FISH、qPCR、TRF和TCA。
[0013]TeSLA代表端粒最短长度测定(Telomere Shortest Length Assay)。这是一种具有良好灵敏度的经典方法，在1kb端粒测量处分辨率较低，并且仅在18kb处具有最大分辨率。这项技术通常应用于人体样本，通量低，而且非常耗费人力。其不适用于超过18kb端粒
长度检测的模型系统，例如，用于小鼠的近交品系。由于这一局限性，首先，TeSLA无法检测到长于18kb的间质端粒序列(ITS)，并且其次，即使在18kb以下，TeSLA也不可能将ITS与端粒信号区分开来4。
[0014]TeSLA需要约1μg的DNA，并与DNA印迹(Southern blot)分析结合使用。其适用于短端粒，但无法用于长端粒长度鉴定。TeSLA由于其1kb
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18kb的窄范围而无法用于与端粒延长或丢失相关的疾病。TeSLA还需要一周的复杂的实验室工作来生成结果，在此期间，每个所需的单独步骤和技术都可能引入时间偏差。最后，TeSLA分析通常需要十五个小时的解释才能提供有价值的结果4。
[0015]另一种方法被称为单链端粒长度分析(Single telomere length analysis，STELA)和被称为通用STELA(U
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STELA)的修改版本。所需的DNA量约为2μg，并且该测定使用连接和基于PCR的方法，并结合DNA印迹(Southern blot)分析。STELA可以提供有关最短端粒丰度的详细信息。据报告，通用STELA(U
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STELA)方法使用抑制PCR策略检测每条染色体的端粒，以防止基因组内DNA片段的扩增。STELA的局限性在于其只能作用于染色体末端的特定子集。而U
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STELA被设计用于鉴定具有小于约500bp的低分子量的DNA。然而，这些方法不足以充分抑制较大基因组DNA片段的扩增，并且U
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STELA无法有效检测超过8kb的端粒长度。这些方法也很费力，需要两周的工作台工作，而且随后的结果分析很复杂，需要约48小时5。
[0016]另一种端粒检测技术是20世纪80年代开发的荧光原位杂交(fluorescence in
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situ hybridization，FISH)。这是一种细胞遗传学技术，使用荧光探针与染色体结合，具有高度的互补性。该技术是检测细胞(包括各种组织和肿瘤中的细胞)中RNA或DNA序列的简便方法。这项技术可用于鉴定染色体异常、基因作图、表征体细胞杂种、检查扩增基因以及研究重排机制。
[0017]RNA FISH用于测量和定位组织切片或全层铺片内的mRNA和其他转录本。其通过探针的强度测量长度。
[0018]定量FISH(Quantitative
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FISH)(Q
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FISH)是一种用于定量测量与探针杂交的DNA片段长度的方法。Q
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FISH的分辨率估计为200bp，并且通过Q
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FISH测量的端粒的平均荧光强度与端粒限制性片段的平均大小相关。其通过探针的强度测量长度，并且端粒长度可以通过使用活细胞或固定细胞进行测量。Q
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FISH可以量化每个细胞核中的每个端粒信号，但可能会低估最短端粒的百分比。对于细胞分裂中期，Q
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FISH可以检测每条染色体的端粒，然而，这种方法不允许对非分裂细胞(如衰老细胞或静息淋巴细胞)进行分析。在flow
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FISH和HT Q
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FISH中使用静息细胞或间期细胞适用于大规模研究，通常用于估计间期细胞的平均端粒长度。虽然这些方法是对Q
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PCR的改进，但这些技术的一个缺点是探针不仅与端粒重复序列结合，而且与细胞质中的非特异性成分相互作用。探针杂交动力学不允许对最短端粒(<2
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3kb)进行稳健定量，并且不可能区分间质端粒序列(interstitial telomere sequences，ITS)。此外，湿实验室工作大约需要五天，分析大约需要十二个小时。
[0019]一种用于可视化端粒的替代方法是定量聚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于全基因组或染色体特异性检测端粒的方法，所述方法包括：分离或获得包含染色体DNA的基因组DNA，将标记的端粒特异性探针、亚端粒特异性探针和/或染色体特异性探针与DNA杂交一段时间，并在适合所述探针与DNA杂交的条件下，复染未与探针杂交的基因组DNA序列，检测所述杂交标记探针在所述染色体DNA上的位置或模式，从而提供关于所述端粒、亚端粒或染色体特异性DNA在所述染色体上的位置的数据；和分析所述数据；并且任选地，当检测到疾病、病症或病况与一条或多条染色体中杂交的位置或模式之间的相关性时，治疗受试者。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括治疗从其分离或获得基因组DNA的受试者的疾病、病症或病况，所述疾病、病症或病况与端粒序列和对照值相比缩短、缺失、重排、异常或延长相关。3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括治疗受试者的与端粒缩短相关的疾病、病症或病况。4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括治疗受试者的与端粒缺失相关的疾病、病症或病况。5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括治疗受试者的与端粒延长相关的疾病、病症或病况。6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括治疗受试者的与端粒重排或其他异常相关的疾病、病症或病况。7.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括当检测到相关性时，治疗从其分离或获得基因组DNA的受试者的衰老、压力暴露，包括糖尿病、肥胖、心脏病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、精神疾病，例如抑郁症、焦虑症、创伤后应激障碍(PTSD)、双相型障碍和精神分裂症。8.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括治疗受试者的与端粒缩短相关的疾病、病症或病况，其中当检测到相关性时，所述疾病是面肩肱型肌营养不良症(FSHD)。9.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括当检测到相关性时，治疗受试者的赘生物、肿瘤或癌症。10.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括当检测到相关性时，治疗受试者的胶质瘤、浆液性低度恶性潜能卵巢癌、肺腺癌、神经母细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤、睾丸癌、肾癌或子宫内膜癌。11.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括当检测到相关性时，治疗受试者的乳腺癌。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述检测还包括记录所述探针在所述染色体DNA的p臂和/或q臂上的位置。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述分析包括计算机分析关于一条或多条染色体上的端粒、亚端粒或染色体特异性DNA的杂交模式的数据。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述分析包括计算机分析关于一
条或多条染色体上的端粒长度的杂交数据。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述分析包括所述杂交模式与一种或多种症状的计算机相关性。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述分离还包括分子梳理所述包含染色体DNA的基因组DNA。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述探针用颜色或荧光染料标记。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述探针包括红色、绿色和黄色标记的探针，并且其中未与探针杂交的染色体DNA被复染成蓝色。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述探针用半抗原标记，所述半抗原由颜色标记的半抗原特异性抗体或者半抗原特异性抗体和颜色标记的二级抗体识别。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，所述检测包括手动可视化所述杂交探针在所述染色体DNA上的位置或模式。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使用图像扫描仪(例如或S扫描仪)扫描所述杂交探针在染色体上的位置或模式。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，所述方法还包括计算机分析描述所述杂交探针的位置或模式的数据。23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述探针是p臂或q臂特异性的。24.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述探针是p臂或q臂基因座特异性的。25.根据权利要求1至24中任一项的方法，所述方法包括基因组DNA中端粒和亚端粒序列的全基因组检测，其中，所述探针与所述基因组DNA中染色体的p臂和/或q臂上的端粒和亚端粒序列结合，并且其中所述检测包括区分端粒和亚端粒序列与间质端粒序列(ITS)。26.根据权利要求1至24中任一项的方法，所述方法包括基因组DNA中端粒和亚端粒序列的全基因组检测，还包括在分离之前用dNTP类似物脉冲所述基因组DNA；其中，所述探针与所述基因组DNA中染色体的p臂和/或q臂上的端粒和亚端粒序列结合，并且其中所述检测包括检测所述基因组DNA中一个或多个染色体臂上的端粒与对照值相比的平均延长率。27.根据权利要求1至24中任一项的方法，所述方法包括基因组DNA中端粒和亚端粒序列的全基因组检测，其中，所述探针与所述基因组DNA中染色体的p臂和/或q臂上的端粒和亚端粒序列结合，并且其中所述检测包括检测所述基因组DNA染色体上的端粒与对照值相比的缩短。28.根据权利要求1至24中任一项的方法，所述方法包括基因组DNA中端粒和亚端粒序列的全基因组检测，其中，所述探针与所述基因组DNA中染色体的p臂和/或q臂上的端粒和亚端粒序列结合，并且其中所述检测包括检测染色体的p臂和/或q臂上与对照值相比的端粒丢失。29.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，所述方法包括基因组DNA中端粒和亚端粒序列的染色体特异性检测，其中，所述探针与所述基因组DNA中染色体的p臂和/或q臂上的染色体特异性、端粒和亚端粒序列结合，并且其中所述检测包括区分所述染色体上的端粒和亚端粒序列与间质端粒序列(ITS)。
30.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，所述方法包括基因组DNA中靶染色体特异性、亚端粒和端粒序列的靶染色体特异性检测，还包括在分离前用dNTP类似物脉冲所述基因组DNA，其中，所述探针与...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：基因组影像公司，
类型：发明
国别省市：