本发明专利技术公开了一种具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法，包括如下操作步骤：1)将尖吻蝮蛇毒溶解、离心，经DE‑52柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测，共获得七个峰的洗脱液，收集目标为IV峰的洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得初级产物Ⅰ，再进行下一步层析；2)将初级产物Ⅰ溶解、离心，经C‑25柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测目标峰的所有洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得中级产物Ⅱ，再进行下一步层析；3)将中级产物Ⅱ溶解、离心，经G‑75柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测目标峰的所有洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得目标产物具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒AAVC‑I。
Purification of Agkistrodon acutus venom with anti-oral squamous cell carcinoma activity
【技术实现步骤摘要】
一种具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法。
技术介绍
蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，主要成份是毒性蛋白质，约占干重的90％至95％。酶类和毒素约含二十多种。此外，还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等。蛇毒成分十分复杂，不同蛇毒的毒性、药理及毒理作用各具特点。蛇毒是毒蛇分泌出来的一种含有多种酶类的毒性蛋白质、多肽类物质，也是毒蛇咬人后引起中毒反应的物质。新鲜的蛇毒为略带腥味的蛋清样粘稠液体，呈黄色、淡黄色、绿色，甚至无色。新鲜时呈中性或弱酸性反应，放置稍久可变成碱性，含水量50％～75％，比重在1.030～1.080之间。新鲜毒液接触空气易产生泡沫，室温下放置24小时易腐败变质，丧失其毒性。冰箱中可以保持15～30天，在-40℃保存时间较久，经过真空干燥或冷冻干燥处理后的蛇毒可于室温下保存20～30年，但毒性强度和一些酶的活性会不同程度的降低，遇水仍能溶解。目前已有研究表明：蛇毒具有抗癌作用，中国医科大学蛇毒研究室试图从辽宁大连蛇岛产的蝮蛇毒中找到能抑制肿瘤生长有效成分，开展了蛇岛蝮蛇的原毒与分离毒对比抑制肿瘤试验，9个不同浓度的蛇毒对小鼠肉瘤均有不同程度的抑制作用，抑瘤率有的高达87.1％。蛇毒具有抗凝作用，中国云南昆明动物研究所从中国五步蛇毒中提取研制的“去纤酶”于1981年通过技术鉴定，用于治疗血管血栓病333例，其中脑血栓242例，有效率86.4％.中国医科大学与沈阳药学院协作研制的蝮蛇抗酸酶，用于治疗血管闭塞性疾病在临床上取得满意效果.中国医科大学蛇毒研究室研制出蛇毒抗酸酶，能降血脂，扩张血管，减少血中血栓素含量，增加前列环素，使血管平滑肌舒张，是理想的抗凝溶栓制剂。此外，蛇毒还具有止血作用、镇痛作用、美容作用。尖吻蝮蛇毒尤其具有凝血酶样作用(也有抗凝血酶元及纤维蛋白溶解作用)，因此纯化尖吻蝮蛇毒对进一步研究具有重要意义。经检索，接近的对比文件中国专利(申请号201210559390.7)公开了一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法，包括将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，在缓冲液中加入乙醇以去除内毒素，得到初级产物I；在结合条件下，将初级产物I经阴离子/疏水复合填料的交换层析，得到中级产物II；将中级产物II经疏水层析，得到纯化的高纯度重组人血清白蛋白目标物。用该专利技术的层析方法分离纯化后得到的重组人血清白蛋白纯度达99.9999％，内毒素含量达到我国药典规定的标准。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法。本专利技术采用的技术方案是：一种具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法，包括如下操作步骤：1)将尖吻蝮蛇毒溶解、离心，经DE-52(纤维素DE-52中等碱性阴离子交换剂)柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测(共为7个组分)，共获得七个峰的洗脱液，收集目标为IV峰(第四峰，纵轴为毫吸光度，单位(mAbsorbanceUnit)以下相同)的洗脱液，将其装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000(聚乙二醇脱水液)中脱水，冻干后得初级产物Ⅰ，再进行下一步柱层析；2)将初级产物Ⅰ溶解、离心，经C-25(葡聚糖凝胶CM-SephadexC-25)柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测目标峰(单峰)的所有洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000(聚乙二醇脱水液)中脱水，冻干后得中级产物Ⅱ，再进行下一步柱层析；3)将中级产物Ⅱ溶解、离心，经G-75(葡聚糖凝胶G-75层析柱)柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测目标峰(单峰)的所有洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000(聚乙二醇脱水液)中脱水，冻干后得目标产物具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒AAVC-I。其中，所述步骤1)中，溶解：按比例，称取五步蛇毒1g，先用9mlPBS起始缓冲液在小烧杯中溶解蛇毒30分钟，待蛇毒完全溶解后平均分装至两个8ml离心管中，再加入1mlPBS起始缓冲液冲洗小烧杯中附壁的蛇毒混合均匀，再次分装至两个离心管中，即每管5ml；2)离心：将上述两个离心管放入离心机中，设置温度为4℃，转速为6000r/min，离心时间15min，离心完成后，缓慢吸取管内蛇毒上清液于10ml离心管中，待上样；3)上样：用胶头吸管吸取蛇毒样品液，移至柱内后加样，顺序为：先沿柱内壁，再至柱中央缓慢加入；打开阀门，继续加样。其中，所述步骤2)中，按比例，溶解：按比例，称取将初级产物Ⅰ1g，先用9mlPBS起始缓冲液在小烧杯中溶解蛇毒30分钟，待将初级产物Ⅰ完全溶解后平均分装至两个8ml离心管中，再加入1mlPBS起始缓冲液冲洗小烧杯中附壁的初级产物Ⅰ混合均匀，再次分装至两个离心管中，即每管5ml；2)离心：将上述两个离心管放入离心机中，设置温度为4℃，转速为6000r/min，离心时间15min，离心完成后，缓慢吸取管内将初级产物Ⅰ上清液于10ml离心管中，待上样；3)上样：用胶头吸管吸取将初级产物Ⅰ样品液，移至柱内后加样，顺序为：先沿柱内壁，再至柱中央缓慢加入；打开阀门，继续加样。其中，所述步骤3)中，按比例，溶解：按比例，称取中级产物Ⅱ1g，先用9mlPBS起始缓冲液溶解中级产物Ⅱ干粉30分钟，待中级产物Ⅱ完全溶解后平均分装至两个8ml离心管中，再加入1mlPBS起始缓冲液冲洗小烧杯中附壁的中级产物Ⅱ混合均匀，再次分装至两个离心管中，即每管5ml；2)离心：将上述两个离心管放入离心机中，设置温度为4℃，转速为6000r/min，离心时间15min，离心完成后，缓慢吸取管内中级产物Ⅱ上清液于10ml离心管中，待上样；3)上样：用胶头吸管吸取中级产物Ⅱ样品液，移至柱内后加样，顺序为：先沿柱内壁，再至柱中央缓慢加入；打开阀门，继续加样。其中，上述操作步骤中的透析袋经过预处理：先将新透析袋放入清水中浸泡3～5小时(用过的则应放入50％乙醇中浸泡数小时，然后在流水下将透析袋内外揉洗数遍放于清水中浸泡)，将泡好的透析袋捞至按体积比为1:1的10mol/LNaHCO3和1mol/LEDTA(乙二胺四乙酸)混匀液中，并于电炉上加热，待煮沸后10分钟拔去电源，透析袋冷却后用玻璃棒挑起透析袋于盛有双蒸水的烧杯中浸泡，5分钟后用双蒸水流水彻底冲洗干净透析液，并于1000ml双蒸水中保存，待用。其中，上述操作步骤中的PEG6000(聚乙二醇脱水液)是按如下比例：WPEG6000：VH2O＝180g：720ml配置所得。其中，上述操作步骤中的DE-52、C-25柱层析介质经过预处理：浸泡：首先用0.5mol/LNaOH浸泡，同方向搅拌并充分混匀；静置30min；倒去上清液，加双蒸水，洗至混匀液PH＝7；然后用0.5mol/LHCL浸泡介质，同方向搅拌并充分混匀，静置30min；倒去上清液，加双蒸水，洗至混匀液PH＝7；最后用0.5mol/LNaOH浸泡介质，同方向搅拌并充分混匀，倒去上清液，加双蒸水，洗至混匀液PH＝7；倒去上清液，再用起始缓冲液浸泡达平衡；抽气：将柱层析介质沿玻璃棒缓慢倒入抽气瓶。(首次使用时需抽气，浸泡液体后不需)抽气30s-停5s-抽30s，反复本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法，包括如下操作步骤：1)将尖吻蝮蛇毒溶解、离心，经DE‑52柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测，共获得七个峰的洗脱液，收集目标为IV峰的洗脱液，将其装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得初级产物Ⅰ，再进行下一步柱层析；2)将初级产物Ⅰ溶解、离心，经C‑25柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测目标峰的所有洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得中级产物Ⅱ，再进行下一步柱层析；3)将中级产物Ⅱ溶解、离心，经G‑75柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测目标峰的所有洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得目标产物具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒AAVC‑I。
【技术特征摘要】
1.一种具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法，包括如下操作步骤：1)将尖吻蝮蛇毒溶解、离心，经DE-52柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测，共获得七个峰的洗脱液，收集目标为IV峰的洗脱液，将其装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得初级产物Ⅰ，再进行下一步柱层析；2)将初级产物Ⅰ溶解、离心，经C-25柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测目标峰的所有洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得中级产物Ⅱ，再进行下一步柱层析；3)将中级产物Ⅱ溶解、离心，经G-75柱层析，按紫外检测280nm光谱图检测目标峰的所有洗脱液，装入透析袋中，经双蒸水中脱盐、PEG6000中脱水，冻干后得目标产物具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒AAVC-I。2.如权利要求1所述的具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法，其特征在于：其中，所述步骤1)中，溶解：按比例，称取五步蛇毒1g，先用9mlPBS起始缓冲液在小烧杯中溶解蛇毒30分钟，待蛇毒完全溶解后平均分装至两个8ml离心管中，再加入1mlPBS起始缓冲液冲洗小烧杯中附壁的蛇毒混合均匀，再次分装至两个离心管中，即每管5ml；2)离心：将上述两个离心管放入离心机中，设置温度为4℃，转速为6000r/min，离心时间15min，离心完成后，缓慢吸取管内蛇毒上清液于10ml离心管中，待上样；3)上样：用胶头吸管吸取蛇毒样品液，移至柱内后加样，顺序为：先沿柱内壁，再至柱中央缓慢加入；打开阀门，继续加样。3.如权利要求1所述的具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法，其特征在于：上述操作步骤中的透析袋经过预处理：先将新透析袋放入清水中浸泡3～5小时，将泡好的透析袋捞至按体积比为1:1的10mol/LNaHCO3和1mol/LEDTA混匀液中，并于电炉上加热，待煮沸后10分钟拔去电源，透析袋冷却后用玻璃棒挑起透析袋于盛有双蒸水的烧杯中浸泡，5分钟后用双蒸水流水彻底冲洗干净透析液，并于1000ml双蒸水中保存，待用。4.如权利要求1所述的具有抗口腔鳞癌活性的尖吻蝮蛇毒的纯化方法，其特征在于：上述操作步骤中的PEG6000是按如下比例：WPEG6000：VH2O＝180g：720m...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪胜松，张根葆，孔天瀚，廖国奇，李红艳，方静，
申请(专利权)人：安徽省祁门县蛇伤研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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