一种重组蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种重组蛋白的纯化方法，包括将重组蛋白的发酵液依次经过Blue Bestarose 6 Fast Flow层析、Phenyl Bestarose High Performance‑硫酸铵疏水层析、Bestarose Diamond MD层析、Phenyl Bestarose High Performance‑氯化钠疏水层析和Bestarose DEAE Fast Flow层析。本发明专利技术的重组蛋白的纯化方法，提供了具有连贯性好，操作性强且杂质去除和目的蛋白回收率好的一套完整纯化工艺方法；而且，纯化获得的原液经质量检定，检定结果均符合制造与检定规程的要求。

A Purification Method of Recombinant Protein

The invention belongs to the technical field of protein purification, and specifically relates to a method for purifying recombinant protein, including successively passing the fermentation broth of the recombinant protein through Blue Bestarose 6 Fast Flow chromatography, Phenyl Bestarose High Performance Ammonium Sulfate Hydrophobic Chromatography, Bestarose Diamond MD Chromatography, Phenyl Beose Star High Performance Sodium Chloride Hydrophobic Chromatography and Bestarose DEAE F Hydrophobic Chromatography. Ast Flow Chromatography. The purifying method of the recombinant protein of the invention provides a complete purification process method with good coherence, strong operability, impurity removal and good target protein recovery rate; moreover, the purified raw liquid is verified by quality, and the verification results meet the requirements of manufacturing and verification regulations.

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白的纯化方法
本专利技术属于蛋白纯化
，具体涉及一种重组蛋白的纯化方法。
技术介绍
人血清白蛋白(HSA)是以具有585个氨基酸的蛋白质，它是血清中渗透压的一个重要组成部分，而且起内源和外源配体的载体的作用。白蛋白作为一种载体分子的作用及其惰性性质是它作为一种稳定剂和多肽的运载蛋白的必需特征。白蛋白作为融合蛋白的组份，已经广泛用于稳定其它蛋白质。HSA通过遗传操作的方法，使得编码HSA的DNA或其片段与编码所说的多肽的DNA连接。然后，用该融合核苷酸转化或转染合适的宿主，从而使得合适的质粒表达融合多肽。重组蛋白是利用重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质，即人工设计的蛋白分子。重组蛋白的制备过程中生成的产物，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等；这就要求将目标蛋白与其它成分分离，并得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。简言之，重组蛋白纯化就是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质，在根据蛋白的差异性将目的蛋白分离出来。重组蛋白的纯化处于重组蛋白表达的下游处理阶段，且与上游过程紧密相联。所以在对目的蛋白表达纯化时，要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游对下游的影响。其中，重组蛋白的分离纯化需要考虑以下两点：一、应尽可能利用蛋白质不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同技术多次进行重组蛋白的纯化；二、不同的蛋白在性质上有很大区别，每一步重组蛋白的纯化步骤都应当充分利用目的蛋白和杂质成分物理性质的差异。现有技术中，针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型，包括离子交换法IEX、亲和层析AC、疏水和反相层析、凝胶过滤层析等。到目前为止，并没有一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来，只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一套综合的分离流程，以获得较高纯度的蛋白产品。
技术实现思路
基于现有技术中存在的上述不足，本专利技术提供一种重组蛋白的纯化方法。为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种重组蛋白的纯化方法，包括将重组蛋白的发酵液依次经过BlueBestarose6FastFlow层析、PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析、BestaroseDiamondMD层析、PhenylBestaroseHighPerformance-氯化钠疏水层析和BestaroseDEAEFastFlow层析。作为优选方案，所述BlueBestarose6FastFlow层析的工艺条件包括：所述重组蛋白的发酵液的上样量为15～25mg/mL、流速为40～50cm/h、上样蛋白浓度≤15mg/mL；平衡液为20～30mMNaAC-2～3mMEDTA-0.25～0.4MNaCl，pH为5.0～5.5；第一步洗杂的洗杂液为0.25～0.35MNaCl-20～35mMTris-2～3.5mMEDTA，pH为7.5～8.5；第二步洗杂的洗杂液为20～30mMTris-2～3mMEDTA-5～10％乙醇，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mMTris-2～3mMEDTA-2～3MNaCl-20～30％乙醇，pH为7.5～8.5；在洗脱过程中收集第二个洗脱峰组份，以得到BlueBestarose6FastFlow层析的下样。作为优选方案，所述BlueBestarose6FastFlow层析的下样经过稀释配制后直接进行PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析。作为优选方案，所述PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的工艺条件包括：将稀释配制后的BlueBestarose6FastFlow层析的下样进行上样，上样量为10～15mg/mL、流速为40～50cm/h；平衡液为20～30mMTris-2～3mMEDTA-0.7～1M硫酸铵，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mMTris-2～3mMEDTA-0.2～1M硫酸铵。作为优选方案，所述PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的过程包括多次洗脱处理，洗脱所用的洗脱液中的硫酸铵的浓度依次降低；当UV示数大于100时开始收集洗脱组份；其中，洗脱组份分段接样，根据相关蛋白及电泳结果进行合样处理，以得到PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的下样。作为优选方案，所述BestaroseDiamondMD层析的工艺条件包括：将PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的下样采用稀释液稀释至电导率为15～25mS/cm以进行上样，上样量为10～20mg/mL，流速为50～70cm/h；平衡液为20～30mMPB-0.3～0.4MNaCl，pH为7.5～8.5；洗杂液为20～30mMPB-0.6～0.8MNaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mMNaAC-2～3mMEDTA-0.2～0.3MNaCl，pH为3～5。作为优选方案，所述BestaroseDiamondMD层析的工艺条件还包括：洗脱样品采用去除洗脱峰首尾的方式进行收集，洗脱峰起始后开始接样至核酸蛋白检测仪吸收值降至约1/4峰高处停止接样，以得到BestaroseDiamondMD层析的下样。作为优选方案，所述PhenylBestaroseHighPerformance-氯化钠疏水层析的工艺条件包括：将BestaroseDiamondMD层析的下样与4～6MNaCl溶液混合以进行上样，上样量为10～15mg/mL，流速为40～50cm/h；平衡液为20～30mMPB-3～4MNaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mMPB-0.8～1MNaCl，pH为7.5～8.5；洗脱组份从洗脱峰起始后开始接样至洗脱结束，以得到PhenylBestaroseHighPerformance-氯化钠疏水层析的下样。作为优选方案，所述BestaroseDEAEFastFlow层析的工艺条件包括：将PhenylBestaroseHighPerformance-氯化钠疏水层析的下样超滤后进行上样，上样量为10～25mg/mL，流速为50～70cm/h，上样蛋白浓度≤10mg/mL；平衡液为5～15mMPB-50～60mMNaCl，pH为7.5～8.5；洗脱液为5～15mMPB-0.1～0.3MNaCl，pH为7.5～8.5；洗脱峰起始后分段收集洗脱组份，将HCP含量不高于25ppm的洗脱组份进行合并，以得到纯化后的重组蛋白原液。作为优选方案，每批次重组蛋白的发酵液均分两次进行BlueBestarose6FastFlow层析，单次BlueBestarose6FastFlow层析的下样量匹配单次PAPhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析，单次PAPhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的下样量匹配单次BestaroseDiamondMD层析、单次BestaroseDiamondMD层析的下样量匹配单次PhenylBes本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组蛋白的纯化方法，其特征在于，包括将重组蛋白的发酵液依次经过Blue Bestarose 6Fast Flow层析、Phenyl Bestarose High Performance‑硫酸铵疏水层析、Bestarose Diamond MD层析、Phenyl Bestarose High Performance‑氯化钠疏水层析和Bestarose DEAE Fast Flow层析。

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白的纯化方法，其特征在于，包括将重组蛋白的发酵液依次经过BlueBestarose6FastFlow层析、PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析、BestaroseDiamondMD层析、PhenylBestaroseHighPerformance-氯化钠疏水层析和BestaroseDEAEFastFlow层析。2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述BlueBestarose6FastFlow层析的工艺条件包括：所述重组蛋白的发酵液的上样量为15～25mg/mL、流速为40～50cm/h、上样蛋白浓度≤15mg/mL；平衡液为20～30mMNaAC-2～3mMEDTA-0.25～0.4MNaCl，pH为5.0～5.5；第一步洗杂的洗杂液为0.25～0.35MNaCl-20～35mMTris-2～3.5mMEDTA，pH为7.5～8.5；第二步洗杂的洗杂液为20～30mMTris-2～3mMEDTA-5～10％乙醇，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mMTris-2～3mMEDTA-2～3MNaCl-20～30％乙醇，pH为7.5～8.5；在洗脱过程中收集第二个洗脱峰组份，以得到BlueBestarose6FastFlow层析的下样。3.根据权利要求2所述的一种重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述BlueBestarose6FastFlow层析的下样经过稀释配制后直接进行PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析。4.根据权利要求3所述的一种重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的工艺条件包括：将稀释配制后的BlueBestarose6FastFlow层析的下样进行上样，上样量为10～15mg/mL、流速为40～50cm/h；平衡液为20～30mMTris-2～3mMEDTA-0.7～1M硫酸铵，pH为7.5～8.5；洗脱液为20～30mMTris-2～3mMEDTA-0.2～1M硫酸铵。5.根据权利要求4所述的一种重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的过程包括多次洗脱处理，洗脱所用的洗脱液中的硫酸铵的浓度依次降低；当UV示数大于100时开始收集洗脱组份；其中，洗脱组份分段接样，根据相关蛋白及电泳结果进行合样处理，以得到PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的下样。6.根据权利要求4所述的一种重组蛋白的纯化方法，其特征在于，所述BestaroseDiamondMD层析的工艺条件包括：将PhenylBestaroseHighPerformance-硫酸铵疏水层析的下样采用稀释液稀释至电导率为15～25mS/cm以进行上样，上样量为10～20mg/mL，流速为50～70...

【专利技术属性】
技术研发人员：林殿海，余登科，李旭，罗玲，何江楠，
申请(专利权)人：浙江优诺金生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33