聚合网状物用于大分子纯化的用途制造技术

从原料中回收目标蛋白质的方法，所述原料包含所述目标蛋白质和至少一种选自宿主细胞蛋白质(HCP)、DNA、RNA或其他核酸的杂质化合物，目标蛋白质的特征在于流体动力学半径Rh1并且杂质化合物的特征在于流体动力学半径Rh2，其中Rh1>Rh2，所述方法包括以下步骤(i)至(iv)和任选的步骤(v)：(i)提供聚合网状物，所述聚合网状物包含至少一种交联的聚合物，所述交联的聚合物含有带正电荷的氨基基团，其中所述聚合物具有孔径排阻极限Rhi，所述Rhi可以可变地设定；(ii)调整聚合网状物的可变孔径排阻极限Rhi，使得Rh2

Purification of Macromolecules by Polymeric Networks

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】聚合网状物用于大分子纯化的用途
本专利技术涉及聚合网状物的用途，所述聚合网状物包含聚合物凝胶或复合材料，用于从含有不需要的化合物和目标化合物的溶液或悬浮液中分离所述不需要的化合物。本专利技术还涉及适用于此目的的特定聚合网状物，以及制备包含所述聚合网状物的复合材料的方法。本专利技术还涉及使用所述聚合网状物从发酵液中回收目标蛋白的方法。特别地，本专利技术涉及通过使用所述复合材料来分离重组蛋白，优选抗体和抗体片段。
技术介绍
纯化的可溶性大分子是整个行业中非常重要的物质。主要在制药和医疗领域报道了对生物聚合物质的日益增长的需求，主要用于治疗和诊断目的，但也用于组织工程等技术。在可用的色谱方法中，由于低容量、低分辨率和低速度引起的众所周知的低生产力，认为尺寸排阻色谱(SEC)不适用于除了精制(polishing)目的之外的大规模操作。特别地，SEC的装载能力通常非常有限，因为分子根据其尺寸的分离在填充柱内最多一个总液体体积内发生。因此，特定固定相的间隙体积和孔体积之间的比例以及孔径(poresize)分布是导致SEC的有限样品体积的主要特征。由于大分子的原始溶液，例如，来自几乎所有生物起始材料的粗提物，特别是来自活组织或死组织、各种培养技术的组织和细胞培养物的粗提物中存在大量不同的杂质，常规色谱纯化过程的第一步通常包括目标化合物的结合(“捕获”)，而大多数不需要的产物完全处于未结合状态或者可以通过选择性洗脱步骤与目标物分离，在该步骤中在目标物质之前或之后释放结合的杂质。然而，就产物回收和整个工艺流程而言，在第一步中结合大部分杂质，而纯化的目标化合物在溶液中保持未结合状态是非常有利的。主要用于抗体纯化的目的，该方法应该允许结合存在于原始原料溶液中的大多数伴随蛋白质，其显示出约10,000Da至100,000Da之间分子量。该分子量范围的蛋白质对应于约1.5nm至5nm流体动力学半径Rh的分子大小。现有技术通常不以这种方式解决相应的问题。对于抗体和其他蛋白质的纯化，已经报道了使用复合吸附剂作为分离剂的一些方法，其包含多种载体材料和氨基聚合物。载体材料是颗粒、过滤介质或膜。聚乙烯亚胺、聚(烯丙胺)和聚(乙烯胺)是优选的官能氨基聚合物，与载体共价连接或在交联后与载体连接。为此目的，基本上应用的色谱方法的特征在于过滤材料或具有颗粒的填充床用各种用于结合和洗脱的缓冲液灌注，同时保留原料的某些化合物。关于基于颗粒的复合材料，WO2013/007793A1、WO2013/007799A1、WO2013/037991A1、WO2013/037992A1、WO2013/037993A1、WO2013/037994A1、WO2013/037995A1(“WO994”族)的专利申请家族包括球形二氧化硅和聚苯乙烯磺酸盐载体的涂层，其具有未知来源的聚乙烯胺。通常这些复合物已经被进一步衍生化，致力于选择性分离多种药物化合物。聚(乙烯胺)涂层的附着通常通过两步程序实现：将载体材料用包括孔的聚合物水溶液浸泡，然后干燥该材料。在第二步中，在将交联剂溶解在合适的有机溶剂(所述有机溶剂不再溶解沉淀的聚合物)中后，在悬浮液中进行交联。WO90/14886公开了一种用于蛋白质分离的复合分离介质，其包含携带多个聚胺的基质，所述多个聚胺与所述基质共价连接。WO95/25574涉及一种从生物流体中除去污染物的方法，其包括使所述生物流体与交联的疏水性聚合网状物接触，所述疏水性聚合网状物覆盖但不共价地结合到多孔矿物氧化物基质上，所述多孔矿物氧化物基质内部多孔体积基本上被所述疏水性网状物填充，由此除去平均分子量低于10,000道尔顿的疏水性和两亲性分子。US6,783,962B1描述了由无孔核心和聚合基质(例如葡聚糖)构成的颗粒材料，其包含可带电荷的侧基或用于结合生物分子的亲和配体。侧端可带电荷的基团是聚乙烯亚胺或改性聚乙烯亚胺，并且可以形成触手状结构。该材料用于分离生物大分子，如DNA。WO2004/073843公开了一种复合材料，其包括具有多个孔的载体构件和填充载体构件的孔的大孔交联凝胶。US2010/0200507A1涉及使用固定在膜上的交联聚胺涂层纯化生物样品。复合制剂的大多数尝试涉及使单体聚合在载体材料体积或表面的空的空间内。这些方法还可包括产生于所述表面的聚合物链的共价连接。本专利技术优选不涉及聚合反应，而是描述预制聚合物的用途。对于包含将预制聚合物永久固定在载体材料上的复合材料的合成，基本上有两种方法可供选择：·将聚合物共价连接在载体材料的表面上·通过交联将聚合物固定在表面上或孔中。共价连接更费力且昂贵，并且另外受限于附着于表面的层厚度。另一方面，如果载体表面是平坦的或不均匀的，那么这是优选的方法，简单地由于稳定性原因，例如与膜、织物或薄纸。交联需要较少的工作量并且适用于多孔材料，因为所得到的网状物被很好地捕获并且可以形成厚层。另一方面，以这种方式涂覆多孔颗粒存在显著的问题，因为它们可能无意地粘在一起和/或孔可能被堵塞。
技术实现思路
为了通过交联将聚合物连接到颗粒或多孔整体载体材料的孔上，再次提供两种合成路线：·首先将聚合物沉淀到载体的内表面，随后通过如下步骤使沉淀后的材料交联：添加溶解在溶剂(所述溶剂不能再溶解所述聚合物)中的交联剂，然后引发这些组分之间的反应，直至已经建立了所需的交联度。该程序明确地避免了孔堵塞和颗粒连接。另一方面，如本专利技术所示(参见图实施方案1.1至1.4和表2)，就聚合物的可进入性(accessibility)而言，获得了不同且不太有利的形态。·同时加入聚合物和交联剂，以便用该混合物填充载体的孔，然后引发这些组分之间的反应。继续反应，直至建立所需的交联度，由此介导所得聚合网状物的固定化，而无需中间物理操作。技术人员将避免将大量或大体积的溶解的预制聚合物和交联剂同时引入到多孔载体材料中进行反应，因为有堵塞载体材料的孔的风险，因此导致改性产物的传质(masstransfer)不良。然而，出乎意料地发现，在本专利技术的合成条件下既没有发生堵塞也没有发生连接。另外，通常不建议预先混合官能聚合物和反应性交联剂。但是，如果交联反应在高温下开始，则如本专利技术中所用的相关方法是优选的。基本上，现有技术避免复合物的“一步合成”，总是进行非成品复合物的中间或后续干燥。而且，现有技术避免在载体孔体积之外存在任何反应性溶液。载体孔被聚合物堵塞和颗粒的无意连接似乎是一个不可克服的问题，现在已经通过本专利技术解决了这个问题。因此，在完成制造过程之前的上游干燥似乎是过去防止这种风险的最佳方式。避免捕获目标化合物步骤的概念可以定义为一种“阴性色谱法”，其特征在于大多数不需要的化合物被“阳性地”吸附并因此被去除。实现这一目标的策略在下面的步骤I、II和III中概述。重要的是要区分所述“通过排阻不结合”与其中目标化合物仅由于例如表面和分子的相同电荷而被吸附剂排斥的任意方法。以下三重辨别机制是特有特征，即使用本专利技术的材料和方法实现的策略：I.去除重组抗体中分子量低于目标物质分子量的物质，例如，大多数宿主细胞蛋白和BSA，其中所述杂质可以源自相应的发酵过程中使用的宿主细胞和细胞培养基。II.同时去除高分子量化合物和纳米颗粒如核酸、病毒及其片段。III.回收目标化合物，一般是太大而不能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从原料中回收目标蛋白质的方法，所述原料包含所述目标蛋白质和至少一种选自宿主细胞蛋白质(HCP)、DNA、RNA或其他核酸或其两种或更多种的组合的杂质化合物，并且任选地进一步包含白蛋白、内毒素、去污剂和微生物或其片段或其两种或更多种的组合，所述原料为溶液或悬浮液形式，并且目标蛋白质的特征在于流体动力学半径Rh1并且杂质化合物的特征在于流体动力学半径Rh2，其中Rh1>Rh2，所述方法包括以下步骤(i)至(iv)和任选的步骤(v)：(i)提供聚合网状物，所述聚合网状物包含至少一种交联的聚合物，所述交联的聚合物含有带正电荷的氨基基团，所述聚合物的特征在于孔径排阻极限Rhi，所述Rhi能被可变地设定；(ii)根据流体动力学半径Rh1和Rh2调整聚合网状物的可变孔径排阻极限Rhi，使得Rh2<Rhi且Rh1>Rhi；(iii)使聚合网状物与原料接触足够的时间以使杂质化合物保留在聚合网状物中并使目标蛋白排阻在聚合网状物之外；(iv)将含有被保留的杂质化合物的聚合网状物与含有被排阻的目标蛋白的原料分离，以获得纯化的原料；(v)任选地，从纯化的原料中分离目标蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.15 EP 16189065.21.一种从原料中回收目标蛋白质的方法，所述原料包含所述目标蛋白质和至少一种选自宿主细胞蛋白质(HCP)、DNA、RNA或其他核酸或其两种或更多种的组合的杂质化合物，并且任选地进一步包含白蛋白、内毒素、去污剂和微生物或其片段或其两种或更多种的组合，所述原料为溶液或悬浮液形式，并且目标蛋白质的特征在于流体动力学半径Rh1并且杂质化合物的特征在于流体动力学半径Rh2，其中Rh1>Rh2，所述方法包括以下步骤(i)至(iv)和任选的步骤(v)：(i)提供聚合网状物，所述聚合网状物包含至少一种交联的聚合物，所述交联的聚合物含有带正电荷的氨基基团，所述聚合物的特征在于孔径排阻极限Rhi，所述Rhi能被可变地设定；(ii)根据流体动力学半径Rh1和Rh2调整聚合网状物的可变孔径排阻极限Rhi，使得Rh2<Rhi且Rh1>Rhi；(iii)使聚合网状物与原料接触足够的时间以使杂质化合物保留在聚合网状物中并使目标蛋白排阻在聚合网状物之外；(iv)将含有被保留的杂质化合物的聚合网状物与含有被排阻的目标蛋白的原料分离，以获得纯化的原料；(v)任选地，从纯化的原料中分离目标蛋白质。2.一种从原料中回收目标蛋白质的方法，所述原料包含所述目标蛋白质和至少一种选自宿主细胞蛋白质(HCP)、DNA、RNA或其他核酸或其两种或更多种的组合的杂质化合物，并且任选地进一步包含白蛋白、内毒素、去污剂和微生物或其片段或其两种或更多种的组合，所述原料为溶液或悬浮液形式，并且目标蛋白质的特征在于流体动力学半径Rh1并且杂质化合物的特征在于流体动力学半径Rh2，其中Rh1>Rh2，所述方法包括以下步骤(i)和(iii)至(iv)和任选的步骤(v)：(i)提供聚合网状物，所述聚合网状物包含至少一种交联的聚合物，所述交联的聚合物含有带正电荷的氨基基团，所述聚合物的特征在于孔径排阻极限Rhi，使得Rh2<Rhi并且Rh1>Rhi；(iii)使聚合网状物与原料接触足够的时间以使杂质化合物保留在聚合网状物中并使目标蛋白排阻在聚合网状物之外；(iv)将含有被保留的杂质化合物的聚合网状物与含有被排阻的目标蛋白的原料分离，以获得纯化的原料；(v)任选地，从纯化的原料中分离目标蛋白质。3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(i)中的所述设定或步骤(ii)中的所述调整或步骤(i)中的所述设定和步骤(ii)中的所述调整通过以下中的一个或多个进行：变化聚合物的结构，选择用于产生聚合网状物的交联剂，选择聚合网状物的交联度，通过改变用于聚合网状物的制备和使用的溶剂来控制聚合网状物的溶胀程度，特别是改变溶剂的pH值，从而改变聚合网状物的质子化程度，并且在聚合网状物被包含在包含聚合网状物和载体的复合物的情况下，控制聚合物的浓度和固定量。4.根据权利要求1或3所述的方法，其包括：在步骤(iii)中的接触之前，平衡步骤(ii)中获得的聚合网状物使pH值低于8；或者根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳斯·戈特沙尔，洛塔尔·布里奇，伊夫林·戈特沙尔，
申请(专利权)人：克拉维格两合股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE