一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型三价灭活疫苗及应用。本发明专利技术公开了三株用于制备副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的菌株的分离、鉴定及疫苗的制备方法，三株疫苗菌株分别为副猪嗜血杆菌2型HN1553株，保藏编号为CGMCC NO：16801、副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株，保藏编号为CGMCC NO：16802、副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株，保藏编号为CGMCC NO：16803。本发明专利技术的疫苗可以很好的预防临床副猪嗜血杆菌血清2型、5型和7型的感染，疫苗制备工艺简单，安全性好，免疫期、免疫效果好。

A trivalent inactivated vaccine against Haemophilus Haemophilus and its application

The invention belongs to the technical field of veterinary biologics, in particular to a trivalent inactivated vaccine of Haemophilus Haemophilus serotypes 2, 5 and 7 and its application. The invention discloses three strains of isolation, identification and vaccine preparation of the strain for preparing the trivalent inactivated vaccine of Haemophilus Haemophilus, and the three vaccine strains are Haemophilus Haemophilus type 2 HN1553 strain, the preservation number is CGMCC NO:16801, the Haemophilus Haemophilus sera 5 type HN1570 strain, the preservation number is CGMCC NO:16802, the Haemophilus Haemophilus sera 7 type HN1565 strain, and the preservation number For CGMCC NO: 16803. The vaccine of the invention can prevent infection of Haemophilus Haemophilus serotypes type 2, 5 and 7, and the preparation process is simple, safe, and immune period and immune effect are good.

【技术实现步骤摘要】
一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其应用
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型三价灭活疫苗制备及应用。
技术介绍
：副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,HPS）是巴氏杆菌科的一种革兰氏阴性多形态小杆菌，为猪副猪嗜血杆菌病的病原菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，临床表现为咳嗽、呼吸困难，腹式呼吸、心跳加快，体表皮肤发红或苍白，耳梢发紫，眼睑皮下水肿，部分病猪出现鼻流脓液，行走缓慢或不愿站立，出现跛行或一侧性跛行、腕关节、跗关节肿大，共济失调，临死前侧卧或四肢呈划水样。有时也会无明显症状而突然死亡，严重时母猪流产。本病在全世界范围内广泛存在，德国学者Glsser于1910年首先报道，又称为革拉氏病（Glsser'sdisease）。副猪嗜血杆菌可以感染各种年龄段的猪，主要发生在断奶后和保育阶段，主要感染2周龄到4月龄的猪，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%，该病已成为近年来断奶、保育仔猪死亡的主要原因之一，是临床混合感染的主要病原之一，给养猪业造成较大的经济损失，严重影响养猪业的健康发展。副猪嗜血杆菌临床血清型较多，标准分型有15个血清型，临床上还有20%以上的不可分型菌株，该病原呈世界性分布，各地流行菌株血清型不一，各血清型之间缺乏免疫交叉保护能力。临床防控副猪嗜血杆菌病的两种途径有抗生素使用和疫苗免疫，但由于国内兽用抗生素不规范滥用及长期使用，导致越来越多的细菌对抗生素产生了耐用性，副猪嗜血杆菌临床分离株耐药现象越来越明显，严重影响了抗生素的杀菌作用。疫苗免疫接种是防控副猪嗜血杆菌病的最佳途径，应根据流行的血清型选择对应的单价或多价疫苗。国内副猪嗜血杆菌商品化疫苗多为针对血清4型、5型、13型的二价或三价疫苗，与各地区主要流行菌株血清型差异较大，导致防控效果不佳。副猪嗜血杆菌各血清型之间缺乏免疫交叉保护，副猪嗜血杆菌灭活疫苗只对同一血清型的菌株有抵抗保护作用，一旦流行菌株血清型与疫苗血清型不符，该疫苗对猪群就无保护作用。
技术实现思路
：针对目前副猪嗜血杆菌各血清型之间缺少免疫交叉保护，副猪嗜血杆菌灭活疫苗只对同一血清型的菌株有抵抗保护的问题，本专利技术提供一种副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型三价灭活疫苗。本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，由三种副猪嗜血杆菌血清型抗原和免疫佐剂制成，所述三种副猪嗜血杆菌血清型抗原分别为已灭活的副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株抗原，其中所述的副猪嗜血杆菌2型HN1553株，保藏编号为CGMCCNO：16801；副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株，保藏编号为CGMCCNO：16802；副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株，保藏编号为CGMCCNO：16803。保藏日期：2018年11月9日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，所述副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株、7型HN1565株的血清型抗原比例为1∶1∶1。上述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，所述副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型抗原的含量均为1×1010CFU/mL。上述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，所述的免疫佐剂为氢氧化铝佐剂。本专利技术还提供一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：a.增殖：将副猪嗜血杆菌血清2型HN1553株、副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株、副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株菌株分别繁殖培养，获得副猪嗜血杆菌HN1553株、HN1570株、HN1565株菌液，并分别进行活菌计数；b.灭活：分别向步骤a中获得的副猪嗜血杆菌HN1553株、HN1570株、HN1565株菌液中按照菌液体积的0.2%加入甲醛溶液，于37℃灭活24h；c.浓缩：使用超滤装置分别浓缩灭活后检验合格的副猪嗜血杆菌HN1553株、HN1570株、HN1565株菌液，根据灭活前的活菌计数，用无菌生理盐水调整浓缩终浓度均为1.0×110CFU/mL；d.制备疫苗：将增殖、灭活、浓缩后获得的副猪嗜血杆菌HN1553株、HN1570株、HN1565株抗原液，按照1∶1∶1的比例混匀，加入终体积10%的氢氧化铝胶佐剂，混匀制得副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗。上述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，所述步骤a中繁殖培养的操作步骤为：（1）一级种子繁殖：将副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株冻干菌种分别接种于TSA平板上，37℃培养18~24小时，挑取符合要求典型菌落，分别传代接种含新生牛血清的TSA平板，于37℃培养24小时，检验合格后，作为一级种子；所述TSA平板中添加有终浓度5％的新生牛血清和终浓度0.01%的NAD；（2）二级种子繁殖：将各株一级种子分别接种于TSB液体培养基中，于37℃，摇床振荡培养18~24小时，进行纯粹检验合格后，作为二级种子；所述TSB液体培养基中添加有终浓度5％的新生牛血清和终浓度0.01%的NAD；（3）将三种菌株的二级种子按1％分别接种于TSB液体培养基中，分别于37℃，摇床振荡培养18～24小时后收获菌液；所述TSB液体培养基中添加有终浓度5％的新生牛血清和终浓度0.01%的NAD。上述任一条所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗在制备预防和治疗副猪嗜血杆菌相关病的药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术从临床分离株中筛选出优势流行菌株副猪嗜血杆菌血清2型HN1553株、5型HN1570株、7型HN1565株菌株，其中菌株HN1553株和HN1570株对保育仔猪具有较强的致病力，引起保育猪发病死亡；本专利技术中的菌株HN1565株对保育仔猪致病力稍弱，但能引起保育仔猪呼吸道症状，发育迟缓，饲料报酬降低；通过试验发现这三株副猪嗜血杆菌均有良好的免疫原性，用这三株副猪嗜血杆菌作为菌株抗原制备的灭活疫苗，可以很好的预防临床副猪嗜血杆菌血清2型、5型和7型的感染，同时该疫苗制备工艺简单，且安全性好，免疫效果好、免疫期长。附图说明图1为菌株HN1553菌落形态。图2为菌株HN1553菌体革兰氏染色100×显微镜下形态。图3为菌株HN1553的PCR鉴定及血清型PCR鉴定结果，图中的Marker为DL2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；泳道1为引物P1、P2扩增HN1553株16SrRNA基因结果；泳道2为引物P3、P4扩增HN1553株WZX基因结果；泳道3为阴性对照。图4为菌株HN1570菌落形态。图5为菌株HN1570菌体革兰氏染色100×显微镜下形态。图6为菌株HN1570的PCR鉴定及血清型PCR鉴定结果，图中的Marker为DL2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；泳道1为引物P1、P2扩增HN1570株16SrRNA基因结果；泳道2为引物P5、P6扩增HN1570株wciP基因结果；泳道3为阴性对照。图7为菌株HN1565菌落形态。图8为菌株HN1565菌体革兰氏染本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于：由三种副猪嗜血杆菌血清型抗原和免疫佐剂制成，所述三种副猪嗜血杆菌血清型抗原分别为已灭活的副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株抗原，其中所述的副猪嗜血杆菌2型HN1553株，保藏编号为CGMCC NO：16801；副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株，保藏编号为CGMCC NO：16802；副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株，保藏编号为CGMCC NO：16803；保藏日期：2018年11月9日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于：由三种副猪嗜血杆菌血清型抗原和免疫佐剂制成，所述三种副猪嗜血杆菌血清型抗原分别为已灭活的副猪嗜血杆菌2型HN1553株、5型HN1570株和7型HN1565株抗原，其中所述的副猪嗜血杆菌2型HN1553株，保藏编号为CGMCCNO：16801；副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株，保藏编号为CGMCCNO：16802；副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株，保藏编号为CGMCCNO：16803；保藏日期：2018年11月9日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌2型、5型、7型血清型抗原比例为1∶1∶1。3.根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌血清2型、5型、7型抗原的含量均为1×1010CFU/mL。4.根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂为氢氧化铝胶佐剂。5.一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.增殖：将副猪嗜血杆菌血清2型HN1553株、副猪嗜血杆菌血清5型HN1570株、副猪嗜血杆菌血清7型HN1565株菌株分别繁殖培养，获得副猪嗜血杆菌HN1553株、HN1570株、HN1565株菌液，并分别进行活菌计数；b.灭活：分别向步骤a中获得的副猪嗜血杆菌HN1553株、HN1570株、HN1565株菌液中按照菌液体积的0.2%加入甲醛溶液，于37...

【专利技术属性】
技术研发人员：王治方，徐引弟，张青娴，朱文豪，许峰，李海利，郎利敏，焦文强，张立宪，游一，王克领，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41