一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组、试剂盒以及方法技术

本发明专利技术提供了一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组、试剂盒以及方法，属于禽流感病毒亚型检测技术领域，所述方法检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组，包括N2‑F和N2‑R；H5‑F和H5‑R以及H9‑F和H9‑R；所述N2‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述N2‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述H5‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述H5‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述H9‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述H9‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。本发明专利技术提供的引物组和试剂盒操作简单、特异性好。

A specific primer group, kit and method for detecting different subtypes of AIV of avian influenza virus

The invention provides a specific primer group, a kit and a method for detecting different subtypes of avian influenza virus AIV, belonging to the technical field of avian influenza virus subtype detection. The method detects specific primer groups of different subtypes of avian influenza virus AIV, including N2 F and N2 R; H5 F and H5 R, H9 F and H9 R; and the nucleotide sequence of N2 F is shown as SEQ ID NO: 1. The nucleotide sequence of the N2_R is shown as SEQ ID NO:2; the nucleotide sequence of the H5_F is shown as SEQ ID NO:3; the nucleotide sequence of the H5_R is shown as SEQ ID NO:4; the nucleotide sequence of the H9_F is shown as SEQ ID NO:5; and the nucleotide sequence of the H9_R is shown as SEQ ID NO:6. The primer group and the kit provided by the invention have simple operation and good specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组、试剂盒以及方法
本专利技术属于禽流感病毒亚型检测
，尤其涉及一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组、试剂盒以及方法。
技术介绍
禽流感是由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)引起的一种急性传染病，被世界动物卫生组织列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病，禽流感给养禽业造成巨大经济损失。甲型流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的差异，将血凝素(HA)分为16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶(NA)分为9个亚型(N1-N9)。AIV的常用检测方法有血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、琼脂扩散试验、逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、RT-PCR法等。HI、琼脂扩散试验等方便快捷，但敏感性较低，不适宜于微量病毒的检测；ELISA、荧光抗体法较为成熟，但不及RT-PCR方法敏感；常规RT-PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，需要特殊的基因扩增仪器。目前对于禽流感病毒不同亚型的检测尚没有一种灵敏度高且操作方便的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于一种灵敏度高、特异性好的检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物、试剂盒以及方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组，包括N2-F和N2-R；H5-F和H5-R以及H9-F和H9-R；所述N2-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述N2-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述H5-F的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述H5-R的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；所述H9-F的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述H9-R的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。优选的，所述引物组中的N2-F、N2-R、H5-F、H5-R、H9-F和H9-R引物的使用浓度独立为15～25μmol/μL。本专利技术提供了一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的试剂盒，包括所述的引物组。优选的，所述试剂盒还包括扩增缓冲液、重组酶聚合酶、ddH2O和醋酸镁。优选的，所述扩增缓冲液为RehydrationBuffer。优选的，所述醋酸镁的浓度为250～300mmoL/L。优选的，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。本专利技术提供了一种非疾病诊断目的的检测禽流感病毒AIV不同亚型的方法，包括以下步骤：1)按照TwistAmpDNAAmplificationKits试剂盒操作说明，将待测样品的DNA、引物组、Rehydrationbuffer和ddH2O混匀后加入醋酸镁获得扩增体系；2)将所述扩增体系置于40℃进行扩增15min后，冷却至20～30℃；混匀后，置于40℃进行再次扩增35min获得扩增产物；3)收集步骤2)中获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若琼脂糖凝胶电泳出现226bp和366bp两条带，则待测样品为H5N2亚型；若琼脂糖凝胶电泳出现226bp和460bp两条带，则待测样品为H9N2亚型。优选的，步骤1)中所述的扩增体系以50μL计，包括待测样品的DNA10μL、引物组2.4μL、扩增缓冲液29.5μL、ddH2O5.6μL和醋酸镁2.5μL。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组，是根据AIV的N2、H5和H9基因序列设计的引物，特异性好；包括所述特异性引物的试剂盒能够快速准确的进行AIV检测，最低检出病毒量为0.1LD50，灵敏度与传统RT-PCR一致。本专利技术提供的试剂盒操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。附图说明图1是实施例1中禽流感病毒多重RT-PCR检测电泳结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-H5N2/H9N2；2-H5N2；3-H9N2；4-新城疫；5-禽白血病；6-鸡传染性支气管炎；7-禽脑脊髓炎；8-禽气管、脑和肝脏等组织混合物；图2是实施例1中禽流感病毒重组酶聚合酶等温检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-103LD50；2-102LD50；3-10LD50；4-1LD50；5-0.1LD50；6-0.01LD50；图3是常规的禽流感病毒RT-PCR检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-103LD50；2-102LD50；3-10LD50；4-1LD50；5-0.1LD50；6-0.01LD50。具体实施方式本专利技术提供了一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组，包括N2-F和N2-R；H5-F和H5-R以及H9-F和H9-R；所述N2-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示(5’-AGCCCRYTGTCAGGAAGTGC-3’)；所述N2-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示(5’-TAGGRTCYCTRCARTTGCTG-3’)；所述H5-F的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示(5’-TCTTCTTGCAATAGTYAGCCTT-3’)；所述H5-R的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示(5’-CTCAAAATGRTTTATTCTGCTC-3’)；所述H9-F的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示(5’-TCTGCTARKTCYTAYCAAAG-3’)；所述H9-R的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示(5’-CCTGARAGRATGTGTCCATACCAT-3’)。优选的，所述引物组中的N2-F、N2-R、H5-F、H5-R、H9-F和H9-R引物的使用浓度独立优选为15～25μmol/μL，更优选为20μmol/μL。本专利技术中，所述N2-F和N2-R对应的特异性扩增片段位于AIVNA(2型)基因的第825-1051位点之间，大小为227bp，核苷酸序列如如SEQIDNO：7所示；所述H5-F和H5-R对应的特异性扩增片段为HA(5型)基因的第61-427位点之间，大小为367bp，核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；所述H9-F和H9-R对应的特异性扩增片段为HA(9型)基因的第410-870位点之间，大小为461bp，核苷酸序列如SEQIDNO：9所示。本专利技术提供了一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的试剂盒，包括所述的引物组。本专利技术中，所述试剂盒优选的还包括扩增缓冲液、重组酶聚合酶、ddH2O和醋酸镁；所述扩增缓冲液为RehydrationBuffer；所述醋酸镁的浓度优选为250～300mmoL/L，更优选为280mmoL/L，本专利技术中，所述醋酸镁的作用为提高反应性能。本专利技术中，所述试剂盒优选的还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品优选为ddH2O，所述阳性对照品优选的包括禽流感病毒H5N2的基因组DNA和禽流感病毒H9N2的基因组DNA。本专利技术提供了一种非疾病诊断目的的检测禽流感病毒AIV不同亚型的方法，包括以下步骤：1)将待测样品的DNA、引物组、Rehydrationbuffer、重组酶聚合酶和ddH2O混匀后加入醋酸镁获得扩增体系；2)将所述扩增体系置于40℃进行扩增15min后，冷却至20～30℃；混匀后，置于40℃进行再次扩增35min获得扩增产物；3)收集步骤2)中获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组，其特征在于，包括N2‑F和N2‑R；H5‑F和H5‑R以及H9‑F和H9‑R；所述N2‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述N2‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述H5‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述H5‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述H9‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述H9‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的特异性引物组，其特征在于，包括N2-F和N2-R；H5-F和H5-R以及H9-F和H9-R；所述N2-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述N2-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述H5-F的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述H5-R的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；所述H9-F的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述H9-R的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组中的N2-F、N2-R、H5-F、H5-R、H9-F和H9-R引物的使用浓度独立为15～25μmol/μL。3.一种检测禽流感病毒AIV不同亚型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增缓冲液、重组酶聚合酶、ddH2O和醋酸镁。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增缓冲液为RehydrationBuffer。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭效珍，刘存霞，胡峰，赵巧雅，姜亦飞，黄兵，马秀丽，李玉峰，于可响，宋敏训，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37