预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及苜蓿黄酮的应用技术

本发明专利技术涉及苜蓿黄酮的应用领域，特别是指预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及苜蓿黄酮的应用。向猪场购买饲喂不同浓度苜蓿黄酮的断奶仔猪结肠；收集进食不同苜蓿黄酮结肠的内容物，并提取结肠内容物中微生物的DNA；以提取结肠微生物的DNA为模板，采用细菌16S通用引物，进行荧光定量PCR检测；分别收集荧光定量PCR产物，用氢氧化钠溶液变性，产生单链DNA片段，构建Miseq文库；根据Miseq文库进行Miseq测序，并对Miseq测序得到的双端序列数据进行分析。苜蓿黄酮对结肠菌群组成具有一定影响作用，且添加0.2%苜蓿黄酮对其影响效果较明显。

Predicting the effect of Alfalfa flavonoids on colonic microflora of weaned piglets and the application of Alfalfa flavonoids

The invention relates to the application field of Alfalfa flavonoids, in particular to a method for predicting the effect of Alfalfa flavonoids on colonic microflora of weaned piglets and the application of Alfalfa flavonoids. Colon of weaned piglets fed with different concentrations of Alfalfa flavonoids was purchased from pig farms; the contents of colon fed with different alfalfa flavonoids were collected, and the DNA of microorganisms in colon contents was extracted; the DNA of colonic microorganisms was extracted as template and detected by fluorescence quantitative PCR using 16S universal primers of bacteria; the products of fluorescence quantitative PCR were collected, denatured with sodium hydroxide solution, and single-stranded DNA was produced. The Miseq library was constructed by fragments. Miseq was sequenced according to Miseq library, and the double-ended sequence data obtained by Miseq sequencing were analyzed. Alfalfa flavonoids have a certain effect on colonic flora composition, and the effect of adding 0.2% alfalfa flavonoids is obvious.

【技术实现步骤摘要】
预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及苜蓿黄酮的应用
本专利技术涉及苜蓿黄酮的应用领域，特别是指预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及提高苜蓿黄酮的应用价值。
技术介绍
饲料中的营养物质不能直接吸收到仔猪体内，必须在消化道中消化才能将大分子有机物质分解成简单的，可溶的，被吸收的小分子。由于消化系统发育不完善，断奶应激而导致断奶仔猪肠损伤引起后续腹泻，最终的结果是采食量减少，消化能力不足，不仅仔猪的健康受到损害，而且还显着降低了仔猪的生长性能，这是对现代化全进全出隔离断奶饲养系统的严峻挑战，也是制约养猪业发展的重要因素。由于缺乏消化酶，仔猪的肠道微生物群落尚未建全，免疫能力差，体温调节能力差，这些决定了饲料营养需求的增加，仔猪的营养状况在后期生长中起关键的影响。以下介绍哺乳仔猪消化生理特点：1）仔猪出生24h内，由于蛋白质和血清蛋白质成分相似，仔猪可以直接吸收初乳，直接吸收到血液中而不转化，从而使仔猪血清Y-球蛋白水平迅速提高，免疫力迅速提高。肠上皮细胞的渗透性随着肠道的发育而变化，并在36-72小时后显著降低；2）仔猪出生后，消化器官小、不发达，在哺乳期增长迅速，随后增长减缓，到8-9月才接近成年水平；3）仔猪出生后，胃中只有凝乳酶，唾液酶和少量的胃蛋白酶；胃底腺发育不良，缺乏游离盐酸，胃蛋白酶无活性，不能消化蛋白质，只有胰腺和肠腺发育较完全，胰蛋白酶，肠淀粉酶和乳糖酶活性较高，胃液分泌不足，仔猪胃和神经系统尚未建立，缺乏条件反射式的胃液分泌，随着年龄的增长和食物的刺激胃壁，盐酸分泌增加，使2.5-3个月龄的酸浓度接近正常猪；4）食物通过消化道的时间很短，15日龄大约1.5小时，30日龄大约3-5小时，60日龄大约16-19小时，成年大约30小时；5）成年猪的大肠中有大量的微生物，种类和数量相对固定;出生在仔猪中的消化道是无菌的，随着吃奶过程，微生物开始出现，并随着生长而增加，直至形成正常的微生物群落。正常微生物抑制病原微生物的繁殖，同时刺激机体的免疫功能，减少消化系统疾病的发生。未断奶仔猪的正常菌群未形成，易发生肠道疾病，消化吸收功能的紊乱与肠道疾病的发生均与肠道微生物区系有关。黄酮类化合物作为一种天然抗氧化剂受到广大学者关注，关于黄酮类化合物抗氧化作用及相关生理生化机制研究也越来越深入。苜蓿黄酮在母猪饲料中作为饲料添加剂应用，但在仔猪方面未见应用。有研究表明，苜蓿黄酮还有抗癌、抗氧化、促进脂质代谢等多种药理作用。苜蓿黄酮在牛羊方面关于免疫、抗氧化的研究很多。但目前，苜蓿黄酮在断奶仔猪免疫及抗氧化性能的研究能应用到仔猪饲料中未见报道。因此，本试验目的是探讨苜蓿黄酮对断奶仔猪生长性能、养分消化率、血清免疫及抗氧化性能、肝脏抗氧化性能影响，为断奶仔猪在免疫及抗氧化方面的分子作用机理机制及苜蓿黄酮能在养猪场中断奶仔猪饲料方面的应用奠定理论基础。随着研究的深入，对苜蓿中生物活性物质研究越来越多，包括苜蓿皂苷、苜蓿黄酮、苜蓿多糖，其中苜蓿黄酮的研究很多，但是苜蓿黄酮在动物上的研究还比较少，特别是猪这一方面，而且作用机理机制在许多方面还不清楚。研究发现，苜蓿黄酮可以改变奶牛瘤胃细菌的群落结构和组成。通过体外培养法，厌氧条件下培养液中大豆异黄酮浓度为100mg/L，对山羊瘤胃代谢影响最显著。研究表明，苜蓿黄酮可以稳定瘤胃绵羊发酵功能，且受添加量影响。苜蓿黄酮对仔猪的生长性能的影响未见报道，苜蓿黄酮和大豆黄酮都属于黄酮类化合物。程忠刚等研究发现，添加大豆黄酮对断奶仔猪生长性能中的平均日增重和料肉比差异不显著。近几十年来，养猪业由于抗生素的滥用，使猪肠道细菌产生了耐药性和药物残留。因此，寻找一种抗生素替代品无药物残留、无耐药性、无副作用的绿色添加剂成为近年来人们关注的热点，其中植物提取物是研究的热点之一。黄酮类化合物由于独特的γ-吡喃苯环结构，因此具有以下多种药理作用，如抗癌，抗氧化，抗菌，促进脂类代谢和类雌激素样作用等，因其促进动物健康和提高生产性能而广受关注。苜蓿黄酮在未来，很有可能作为一种绿色饲料添加剂、保健剂用于仔猪饲料中，使养猪业减少抗生素等药物的应用，提高仔猪机体免疫力。研究肠道微生态的方法很多，高通量测序技术可以全面的反应肠道微生态的丰度及多样性的优点而被广泛应用于研究猪肠道微生物。目前，苜蓿黄酮对猪肠道方面的影响研究未见报道。因此，本试验通过16rDNA高通量测序的方法研究苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系的影响。探讨苜蓿黄酮是如何改变结肠微生物区系来影响仔猪肠道营养及消化代谢的，为苜蓿黄酮在仔猪中的应用提供一些参考价值。
技术实现思路
本专利技术提出预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及提高苜蓿黄酮的应用潜力与价值，研究现有技术中苜蓿黄酮对结肠菌群多样性影响的理论问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，步骤如下：（1）向猪场购买分别以梯度浓度的苜蓿黄酮日粮喂养的断奶仔猪的结肠；（2）收集进食不同苜蓿黄酮结肠的内容物，并提取结肠内容物中微生物的DNA；（3）以提取结肠微生物的DNA为模板，以细菌16S通用引物为引物，进行荧光定量PCR检测；（4）分别收集荧光定量PCR产物，用氢氧化钠溶液变性，产生单链DNA片段，构建Miseq文库；（5）根据Miseq文库进行Miseq测序；（6）对Miseq测序得到的双端序列数据进行分析。所述苜蓿黄酮日粮是指向基础日粮中添加基础日粮质量0.1-5%wt的苜蓿黄酮。所述16S通用引物为338F序列如5´-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3´所示、806R序列如5´-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3´所示。所述双端序列数据进行分析的步骤为：根据PEreads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据；通过i-Sanger云分析平台对优化数据进行生物信息学分析，根据序列相似度为97%的原则，将序列分为多个操作分类单元；通过云平台进行细菌群落丰富度和多样性分析，物种组成分析，样本比较分析，物种差异分析及进化分析。苜蓿黄酮作为断奶仔猪日粮添加剂的应用，步骤为：向基础日粮中加入其质量0.1-5%wt的苜蓿黄酮。苜蓿黄酮作为调节结肠菌群的应用，苜蓿黄酮作为提高梭菌属、粪球菌属、真细菌属、NC2004属、Anaerotruncus属细菌的相对丰度和降低NK3B31属、Alloprevotella属、Blautia属、拟杆菌属相对丰度的应用。本专利技术的有益效果在于：（1）随着苜蓿黄酮添加量的增加，厚壁菌门相对丰度呈曲线升高趋势(P＞0.05)，拟杆菌门相对丰度呈曲线下降趋势(P＞0.05)。在属水平上，UCG-014、Erysipelotrichaceae和胃球菌属相对丰富度各组间差异显著（0.01＜P＜0.05），Anaerotruncus相对丰度各组间差异极显著（P＜0.01）。梭菌属相对丰度中，Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组都高于对照组（P＜0.05）。随着苜蓿黄酮添加量的增加，乳酸菌属相对丰度呈先下降再上升再下降的趋势而Ⅳ组与对照组相比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，其特征在于，步骤如下：（1）向猪场购买饲喂不同浓度苜蓿黄酮的断奶仔猪结肠；（2）收集进食不同苜蓿黄酮结肠的内容物，并提取结肠内容物中微生物的DNA；（3）以提取结肠微生物的DNA为模板，采用细菌16S通用引物，进行荧光定量PCR检测；（4）分别收集荧光定量PCR产物，用氢氧化钠溶液变性，产生单链DNA片段，构建Miseq文库；（5）根据Miseq文库进行Miseq测序；（6）对Miseq测序得到的双端序列数据进行分析。

【技术特征摘要】
1.预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，其特征在于，步骤如下：（1）向猪场购买饲喂不同浓度苜蓿黄酮的断奶仔猪结肠；（2）收集进食不同苜蓿黄酮结肠的内容物，并提取结肠内容物中微生物的DNA；（3）以提取结肠微生物的DNA为模板，采用细菌16S通用引物，进行荧光定量PCR检测；（4）分别收集荧光定量PCR产物，用氢氧化钠溶液变性，产生单链DNA片段，构建Miseq文库；（5）根据Miseq文库进行Miseq测序；（6）对Miseq测序得到的双端序列数据进行分析。2.根据权利要求1所述的预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，其特征在于：所述苜蓿黄酮日粮是指向基础日粮中添加基础日粮质量0.1-5%wt的苜蓿黄酮。3.根据权利要求1所述的预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，其特征在于：所述16S通用引物为338F序列如5´-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3´所示、806R序列如5´-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3´所示。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：严学兵，曲根，郭玉霞，郭志鹏，管用卓，张靖雪，王苗利，刘建宇，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41