一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗。本发明专利技术制备的产气荚膜梭菌β毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有多个氨基酸突变的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力优良等优点，较我国目前商品化的产气荚膜梭菌天然毒素灭活疫苗大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是我国现行B型和C型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

A Non-toxic Clostridium perfringens Beta Toxin Genetically Engineered Vaccine and Its Production Method

The invention relates to a non-toxic Clostridium perfringens beta toxin genetic engineering vaccine. The recombinant subunit vaccine for producing Clostridium perfringens beta toxin prepared by the invention adopts the recombinant Clostridium perfringens beta toxin protein produced by codon optimization and containing multiple amino acid mutations, that is, to maximize the integrity and spatial conformation of the natural toxin protein, thereby maintaining its immunogenicity, and avoiding the potential biological safety hazards caused by single amino acid mutation. Compared with the commercialized inactivated Clostridium perfringens natural toxin vaccine in China, the vaccine has the advantages of simple preparation process, low immune dosage and good vaccine efficacy. It greatly reduces the risk of biosafety in the production of vaccine, and is an ideal candidate vaccine for upgrading of Clostridium perfringens B and C vaccines in China. It is also prepared in conjunction with other antigens. The combined seedlings can be prepared without increasing the dosage of the combined seedlings.

【技术实现步骤摘要】
一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病，其中，对畜牧业危害较大的是羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症、猪红痢等。该菌主要通过其分泌的外毒素致病，根据产生4种主要致死性外毒素α、β、γ和ι的种类，将该菌分为A、B、C、D、E五个毒素型。产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法。目前使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗，虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷。第一是存在生物安全性问题，在该类疫苗的制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。此外，疫苗生产中产生的副产物如培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应特别是联苗中每种菌株的类毒素免疫量均较高，组合后的总免疫量过大，容易引起动物的应激反应；第二是免疫效果不尽理想且不稳定。由于此类灭活疫苗的抗原成分复杂，有效抗原含量较低，导致免疫效果不尽理想，有学者等对自2006年至2015年间的此类疫苗免疫检验结果的统计发现，以血清中和法检验后效力不符合规定的产品共有33批，其β毒素组分效力不符合规定的比例最高，约为72.7％。此外，制备此类疫苗的培养基中需要添加新鲜制备的肉汤，培养基批次间的稳定性无法保障。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。β毒素(CPB)是B型和C型产气荚膜梭菌的主要致病因子，具有细胞毒性和致死性，能导致人和动物的坏死性肠炎。其中，CPB在B型和C型产气荚膜梭菌中高度保守，氨基酸同源性在99％以上。虽然外源重组CPB分子具有一定的免疫保护作用，但需要考虑到蛋白的毒性。已有的研究表明，以可溶性形式表达的重组CPB具有较强的毒力，而以包涵体形式表达的重组CPB的毒力基本上可以忽略。然而，因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要制约因素。根据上述的研究内容，本课题组前期申请的专利“一种产气荚膜梭菌CPB基因工程疫苗及其生产方法”(申请号或专利号：201810868174.8)获得了带有助溶标签麦芽糖蛋白(MBP)的、含有4个氨基酸突变(第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸)的重组融合蛋白，rMBP-CPBm4，结果显示，rMBP-CPBm4以可溶性的形式表达，经纯化后获得了免疫原性良好的无毒抗原蛋白。由于MBP标签具有较大的蛋白分子量(40kDa)较大，从而导致融合蛋白的有效抗原成分降低，且可能会影响融合蛋白的表达水平。为此，选择分子量小、助溶效果较好的助溶标签是重要的环节。已有研究发现，一种小分子泛素样修饰蛋白SUMO(Smallubiquitin-likemodifier)可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。为此，SUMO与CPBm4的融合表达具有重要意义。本专利技术制备的无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，系采用经过密码子优化、含有SUMO标签蛋白和多个氨基酸突变的β毒素的重组融合蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行B型和C型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。
技术实现思路
本专利技术目的在于利用构建的重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白的大肠杆菌制备出产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，用于预防由B型和C型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白的大肠杆菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL/SUB株，该菌株已于2019年01月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17164；所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白与野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变；在N端添加助溶蛋白和C端含有便于蛋白的纯化的标签。2.本专利技术所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素相比，含有多个氨基酸的突变，优选的为4个氨基酸突变为第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸。3.本专利技术所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，其基因序列经过密码子优化，其N端添加的助溶蛋白，优选的为SUMO标签，更易于在大肠杆菌中实现高表达和可溶表达。4.本专利技术所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，含有便于蛋白的纯化的标签优选为C端含有6组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化。5.本专利技术所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。6.本专利技术所述产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于其制备方法为：用所述表达产气荚膜梭菌β毒素重组蛋白的埃希氏大肠菌BL/SUB(Escherichiacoli)BL/SUB(CGMCCNo.17164)株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。本专利技术具有以下新的技术效果1.对β毒素同时进行了多个氨基酸突变，获得了无毒的重组β毒素，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。2.对β毒素的编码基因进行了密码子优化，实现了在大肠杆菌中的高效表达。3.首次将β毒素与小分子量的助溶标签SUMO融合表达，实现了在大肠杆菌中的可溶性表达，获得了有效抗原比例高的融合蛋白，从而一方面避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本，另一方面也避免的大分子量标签蛋白的影响。4.采用基因工程方法制备亚单位疫苗替代传统的培养致病性梭菌制备毒素再灭活脱毒的办法，大大降低了生产过程中的生物安全风险。本专利技术的积极意义本专利技术涉及一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其生产方法。本专利技术将野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素的第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸获得了对于动物体无毒的β毒素突变体(BL/SUB株)。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于该疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白的大肠杆菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/SUB株，该菌株已于2019年01月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17164；该疫苗用于同时预防由B型和C型产气荚膜梭菌感染引起的疾病；所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白与野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变；在N端添加助溶蛋白和C端含有便于蛋白的纯化的标签。

【技术特征摘要】
1.一种无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于该疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌β毒素蛋白的大肠杆菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL/SUB株，该菌株已于2019年01月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17164；该疫苗用于同时预防由B型和C型产气荚膜梭菌感染引起的疾病；所述表达的重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白与野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变；在N端添加助溶蛋白和C端含有便于蛋白的纯化的标签。2.如权利要求1所述无毒性产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌β毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌β毒素成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变，优选的为以下4个氨基酸突变，分别为第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和278位的色氨酸突变为丙氨酸。3.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小云，杜吉革，刘莹，薛麒，朱真，印春生，李启红，康凯，姚文生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11