一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。本发明专利技术将野生型产气荚膜梭菌α毒素的无毒区域C末端进行3次重复串联，获得了对于动物体无毒的α毒素C末端3拷贝重组蛋白，同时，在突变蛋白的C端加上6组氨酸标签，作为制苗用抗原。同时公开了含有所述产气荚膜梭菌α毒素无毒重组蛋白编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。采用本发明专利技术制备的腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗其效力较高，而且大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。此外，凭借疫苗半成品蛋白浓度高的优势，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

A Recombinant Subunit Vaccine Producing Clostridium perfringens Alpha Toxin and Its Production Method

The invention relates to a recombinant subunit vaccine of Clostridium perfringens alpha toxin and a production method thereof. The recombinant protein of 3 copies of C-terminal of wild Clostridium perfringens alpha toxin-producing toxin was obtained by repeating the C-terminal of the toxin-free region three times in series. At the same time, 6 histidine labels were added to the C-terminal of the mutant protein as antigen for seedling production. At the same time, a recombinant expression vector containing the gene encoding the non-toxic recombinant protein of Clostridium perfringens alpha toxin and a recombinant host cell are disclosed. The recombinant Clostridium putrefaciens alpha toxin subunit vaccine prepared by the invention has high efficacy, and greatly reduces the biological safety risk in the vaccine production process. In addition, by virtue of the high concentration of protein in the semi-finished products of the vaccine, the combined vaccine can be prepared without increasing the dosage of the combined vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringeris)是一种重要的人畜共患菌，能引起人类以及多种家畜家禽发病，不仅威胁着人类的健康，而且对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，该菌可产生至少20种外毒素，并通过其发挥致病作用。根据产生4种主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)的种类，可将该菌分为A、B、C、D、E五个毒素型。其中，对养牛业危害最大的是A、C和D型。在国外，牛的产气荚膜梭菌病以C、D型菌引起的牛坏死性肠炎或肠毒血症较多，而在国内，牛的产气荚膜梭菌病则以A型菌引起的牛“猝死症”为主。病牛往往无任何前驱症状，而突然发病死亡。因此，疫苗免疫是防治该病的有效手段，然而国内还没有商品化的疫苗来预防牛的A型产气荚膜梭菌病。虽然灭活疫苗在预防羊的产气荚膜梭菌方面起到了一定的效果，但该类疫苗是通过灭活细菌培养物上清而制备的天然类毒素，制备过程繁琐，抗原成分复杂，有效抗原量较低。如大剂量的肌肉注射会严重破坏牛肉的品质。因此，筛选安全、纯净、有效的抗原对预防该菌感染具有重要意义。CPA是由产气荚膜梭菌染色体基因plc编码，plc存在于五个毒素型的菌株，但在A型毒株中表达水平最高。成熟的CPA由370个氨基酸构成，分为N-末端(1-246，CPAN)和C-末端(247-370，CPAC)两个结构域。其中，CPAN是CPA发挥酶活性的主要区域，而CPAC是毒素与细胞结合的主要区域。研究表明，重组CPA仍存在一定的毒力，而通过甲醛灭活后的天然毒素抗原性会明显降低。为此，研制无毒力的重组毒素具有重要的意义。已有的研究表明，无毒力的CPAC能够对天然CPA起到良好的免疫保护作用。由于CPAC蛋白分子量较小，研究者通常选择将CPAC与GST等大分子量标签蛋白融合表达，从而引入了过多无关的抗原成分。本专利技术专利制备的产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、经3次重复后进行串联表达，不仅增加了有效抗原量，也增加抗原蛋白整体的分子量，更有利于增强分子的抗原性。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是A产气荚膜梭菌毒素疫苗的理想候选抗原。
技术实现思路
本专利技术目的在于制备出产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，用于预防由A型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BLCPA3株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15239。2.本专利技术所述产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌α毒素成熟毒素相比，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌梭菌α毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌梭菌α毒素成熟毒素相比，只含有C末端的三拷贝。同时，在该蛋白的C端加上6组氨酸标签。3.本专利技术所述产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白，其重组表达载体的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。4.本专利技术所述产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。5.本专利技术所述产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌梭菌α毒素蛋白为无毒区域，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。6.本专利技术所述产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于用所述表达产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠埃希氏菌BLCPA3株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、包涵体分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。本专利技术具体实施方式1.产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗的制备(1)菌种：制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BLCPA3株，该菌种表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白含有C末端的3个拷贝，且重组蛋白的C端添加了6组氨酸标签。该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15239；由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。(2)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16小时，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12小时，与50％甘油等比例混合后分装，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。(3)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，即为二级种子。(4)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，发酵罐内培养。设置培养参数为：培养温度37℃，pH值7.0，溶氧40％。当培养物OD600值为10～15时，加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导培养4h。(5)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10ml裂解液(pH值7.20.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/LNaCl)的比例重悬菌体，4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，弃去上清液，收集沉淀的包涵体。(6)纯化：按每克包涵体用5ml溶解液(6mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl，pH值8.0)的比例在室温下以200r/min振荡溶解2小时后，4℃10000r/min离心30min，收集上清液(7)蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量。应不低于0.5mg/ml。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于70％。(8)无菌检验：按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行。应无菌生长。(7)疫苗配制：将双相油佐剂(如201佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.20.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装。2.产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗的检验(1)性状外观乳白色乳剂。剂型呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白C末端的三拷贝；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BLCPA3株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15239。

【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白C末端的三拷贝；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BLCPA3株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15239。2.如权利要求1所述产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌α毒素成熟毒素相比，只含有C末端的三拷贝。同时，在该蛋白的C端加上6组氨酸标签。3.如权利要求1所述产气荚膜梭菌α毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜吉革，陈小云，薛麒，朱真，王磊，印春生，李启红，康凯，姚文生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11