用于治疗和/或预防流感的组合物、方法和用途技术

本发明专利技术提供了用于治疗和/或预防流感的组合物、方法和用途。所述组合物包含经酸酐处理的蛋白质和另一种用于治疗和/或预防流感的药物。本发明专利技术制备的酸酐化蛋白是酸酐化的乳球蛋白，在体外实验中可以广谱地抑制多种亚型流感病毒感染细胞；在动物体内实验中，其具有显著的预防和治疗流感病毒感染的作用。流感病毒具有亚型多、突变率高的特点，使广谱性抗流感制剂的开发十分重要。酸酐化蛋白不仅可抑制多种季节性流感病毒的感染，而且对高致病性禽流感病毒H7N9和曾引起大流行的流感病毒H1N1(2009)也有显著的抑制作用，提示它可被开发成为高效、广谱地防治流感病毒的生物制剂。

Compositions, methods and uses for the treatment and/or prevention of influenza

【技术实现步骤摘要】
用于治疗和/或预防流感的组合物、方法和用途
本专利技术属于蛋白质工程领域，具体地涉及经酸酐处理的蛋白质抑制流感病毒的方法和用途。
技术介绍
流感病毒与流感疫情流行性感冒(Influenza)，是由流感病毒(Influenzaviruses,IVs)感染引起的，可引起急性呼吸道感染，主要是口、咽、支气管甚至肺部的不适，特征是突发高热、咽痛、咳嗽、流涕和肌肉关节痛等，严重的将导致死亡。世界卫生组织在2018年底的统计结果显示，每年仅因季节性流感引起的呼吸道疾病，就会造成全球范围内29万到65万人死亡。历史上四次大规模流感的爆发，每年的季节性流感和新型流感的突发与流行，提示着流感病毒对人类健康有持续性的威胁。流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，是一种高突变率、高致病性的RNA病毒。流感病毒根据核蛋白和基质蛋白抗原决定簇的不同，可划分为甲(A)、乙(B)、丙(C)和丁(D)四个亚型，甲、乙、丙型三种流感病毒都可感染人，其中，甲型流感病毒主要感染人、猪、马和禽类，乙型主要感染人和猪，丙型只感染人，丁型主要感染猪和牛。甲型流感病毒变异性强，是引起人类中流感大流行的原因。甲型流感病毒表面主要有两种糖蛋白，分别是血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)，根据它们抗原性的不同，血凝素HA可被划分为18个亚型H1～H18，神经氨酸酶NA可被划分为11个亚型N1～N11。流感病毒的命名是由HA和NA的组合决定的，例如高致病禽流感H7N9，其命名就是根据重组病毒的HA为H7亚型，NA为N9亚型。人感染的流感病毒，主要通过空气飞沫等，以人传人的方式传播。禽类流感病毒由于与人流感病毒的唾液酸受体偏好性不同，禽类病毒优先与α2,3-唾液酸受体结合，人类适应的病毒与α2,6-唾液酸受体特异性结合，由于人上呼吸道只分布有α2,6-唾液酸受体，因此禽流感病毒不易传染到人类。但近几年爆发的禽流感病毒H5N1和H7N9，提示了新发的，特别是高致病性的流感病毒，可不受受体局限而感染人类，致人感染致死的风险大大增加。流感病毒的防控现状和关键科学问题季节性流感每年发生，接种疫苗仍是预防流感最好的办法。但为应对高变异的流感病毒每年需要重新接种，且疫苗有效性的检验需要三至六个月；疫苗对流感抗原具有选择特异性，对季节性流感的预测往往不准，保护作用受限；且疫苗对于儿童和老人等免疫功能低下人群的保护效果不佳。此外，目前可用的流感疫苗仅能抵抗部分甲型和乙型流感病毒毒株，对于H5N1和H7N9等高致病性禽流感病毒的疫苗尚未批准，这使得流感疫苗的应用有很大的局限性。研究新型的、高效广谱的流感疫苗来抵抗高变异的流感病毒，一直是领域难点。流感病毒感染后治疗主要依赖的已批准药物有离子通道阻滞剂、神经氨酸酶抑制剂和RNA酶抑制剂等。离子通道阻滞剂烷胺类药物，如上市药物金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)，此类药物通过阻断M2离子通道来阻止病毒脱衣壳，以影响病毒的复制过程。离子通道类药物有很多缺陷，如对甲型流感病毒外的病毒无效，出现病毒耐药株及药物本身对中枢神经系统有副作用等，目前已很少应用于流感病毒的治疗。神经氨酸酶抑制剂，如扎那米韦(zanamivir)、奥司他韦(oseltamivir)、拉那米韦(laninamivir)和帕拉米韦(peramivir)，则是通过阻止流感病毒与细胞唾液酸受体结合后的切割，使病毒不能从被感染的宿主细胞中释放，因而可特异性抑制流感病毒。神经氨酸酶抑制剂在使用过程中，已出现多种流感病毒的耐药株，例如奥司他韦在使用两天后就有耐药性产生，帕拉米韦的治疗效果因耐药等问题受限制等。RNA聚合酶抑制剂Xofluza是最新被批准上市的药物，它作用于流感病毒复制周期的早期阶段，通过抑制cap-依赖型核酸内切酶(cap-dependentendonuclease)，来抑制流感病毒的复制。此类药物对H5N1和H7N9病毒有一定的抑制作用，但是否能对未来的新变异的流感病毒起到抑制作用，尚未证实。流感病毒的高突变特征，决定了开发有效的广谱性抗流感药物的重要性。因此，如何获得高效的且广谱性抗流感病毒的新型药物仍然是研究领域的关键科学问题之一。
技术实现思路
本专利技术工作基础姜世勃教授及其科研团队在抗HIV-1病毒的研究中发现，牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)被3-羟基-邻苯二甲酸酐(3-hydroxyphthalicanhydride,HP)修饰后可以抵抗HIV-1病毒入侵细胞，此研究是蛋白类抗病毒药物研究领域的新进展。科研团队在其后证实经HP修饰的β-LG对单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)和人类乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)有抑制作用，而酸酐化修饰后的蛋白质对中东呼吸综合征冠状病毒(Middleeastrespiratorysyndromecoronavirus,MERS-CoV)和寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)等病毒却没有显著活性。后续研究发现，经马来酸酐(maleicanhydride，缩写为ML)修饰的人血清白蛋白(humanserumalbumin，缩写为HSA)可抑制人呼吸道合胞病毒(Humanrespiratorysyncytialvirus,RSV)的感染；经HP修饰的人血清白蛋白可抑制埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)的感染。这些研究提示我们，酸酐化蛋白是否具有抑制感染的作用，仍然有病毒间的差异性存在。发掘酸酐化蛋白的抗病毒潜能，并探究酸酐化蛋白对不同病毒有抑制活性和无显著活性的机制，对蛋白类药物抗病毒作用的研究具有重要意义。流感病毒HA蛋白是病毒表面分布最多的糖蛋白，是流感病毒入侵细胞时起关键作用的部分，若能阻断HA蛋白与细胞上受体的结合，也就能在最早阶段阻断流感病毒感染靶细胞。本专利技术制备的生物制剂基于以上机理，通过修饰后蛋白与HA蛋白相互作用，阻断HA与唾液酸受体的结合，抑制流感病毒感染细胞，从而起到抗病毒的作用。经实验验证，本专利技术制备的蛋白在体内外实验中均可有效地抵抗多种流感病毒的感染，且在体外实验中显示了高的安全性，提示其可作为候选药物用于流感患者的治疗；本专利技术制备的蛋白是以β-LG蛋白电荷修饰为基础的，通过物理作用结合流感病毒血凝素HA，以达到抑制病毒感染的目的，因而不易产生耐药株。本专利技术基于流感病毒的高突变性和高致病性以及流感病毒现有药物的耐药性和局限性，提出一种对多种亚型的季节性流感病毒和高致病性流感病毒有预防和控制作用的生物制剂的制备方法。本专利技术的设计思路在于：蛋白上的碱性氨基酸通过含有特殊官能团的化合物-酸酐的作用而被修饰，酸酐使蛋白带上负电荷，能与病毒表面糖蛋白HA的受体结合域结合，而致流感病毒结合唾液酸受体的途径被阻断，使病毒不能黏附宿主细胞而进入细胞，从而起到阻断病毒感染的作用，实现广谱性抗多种流感病毒的目的。基于这一目的，本专利技术的实施方案如下：1.用于治疗和/或预防流感的组合物，其包含经酸酐处理的蛋白质和任选的另一种用于治疗和/或预防流感的药物，其中优选地所述药物选自：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.在体外使用经酸酐处理的蛋白质抑制流感病毒的方法，其中所述蛋白质选自：乳球蛋白，优选β‑乳球蛋白(β‑lactoglobulin,β‑LG)，更优选牛β‑乳球蛋白；白蛋白，优选牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白；RNA酶，优选RNA酶Ι；优选地，所述方法包括使经酸酐处理的蛋白质和任选地选自奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、Xofluza、金刚烷胺和金刚乙胺的药物与流感病毒接触，所述经酸酐处理的蛋白质是通过将酸酐溶液与蛋白质溶液混合产生的；优选地，其中根据蛋白质中的精氨酸和/或赖氨酸的修饰率测定，所述经酸酐处理的蛋白质是完全酸酐化的；优选地，其中酸酐的终浓度选自3、6、12、24、36、48和60mM或3mM以上其他浓度，优选60mM；优选地，其中所述流感病毒在生物样品，如唾液、血液、血清、痰液中，在生物体，如哺乳动物，如人的表面上，或者在物品表面上。

【技术特征摘要】
1.在体外使用经酸酐处理的蛋白质抑制流感病毒的方法，其中所述蛋白质选自：乳球蛋白，优选β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)，更优选牛β-乳球蛋白；白蛋白，优选牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白；RNA酶，优选RNA酶Ι；优选地，所述方法包括使经酸酐处理的蛋白质和任选地选自奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、拉那米韦、Xofluza、金刚烷胺和金刚乙胺的药物与流感病毒接触，所述经酸酐处理的蛋白质是通过将酸酐溶液与蛋白质溶液混合产生的；优选地，其中根据蛋白质中的精氨酸和/或赖氨酸的修饰率测定，所述经酸酐处理的蛋白质是完全酸酐化的；优选地，其中酸酐的终浓度选自3、6、12、24、36、48和60mM或3mM以上其他浓度，优选60mM；优选地，其中所述流感病毒在生物样品，如唾液、血液、血清、痰液中，在生物体，如哺乳动物，如人的表面上，或者在物品表面上。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸酐选自：3-羟基-邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐和马来酸酐。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酸酐溶液是酸酐的二甲基亚砜溶液，优选地通过将所述酸酐的粉末溶解于二甲基亚砜获得；优选地酸酐溶液的浓度为0.5M以上，优选0.5M-10M，优选1M-5M，更优选1M；其中优选地，所述蛋白质溶液是蛋白质的磷酸盐溶液；其中优选地，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸钠和磷酸钾，优选磷酸氢二钠；其中优选地，所述磷酸盐溶液的pH大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8.5；其中优选地，所述磷酸盐溶液中的蛋白质浓度为5mg/mL以上，10mg/mL-100mg/mL，20mg/mL-80mg/mL，或50mg/mL-70mg/mL，优选20mg/mL；其中优选地，所述经酸酐处理的蛋白质通过将酸酐溶液加入蛋白质溶液，混匀后在将pH维持于大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8.5的情况下温育足以使蛋白质被酸酐溶液完全修饰，如通过蛋白质中的精氨酸和赖氨酸的修饰率测定；然后纯化和任选浓缩经酸酐处理的蛋白质获得；所述经酸酐处理的蛋白质的剂型为溶液、搽洗剂、喷雾剂、盥洗剂和干粉。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述流感病毒选自禽流感假病毒、甲型流感和乙型流感，例如H7N9，甲型流感/Shanghai/4664T/2013(H7N9)；H5N1，甲型流感/QH/59/05(H5N1)，甲型流感/Thailand/Kan353/2004(H5N1)；H3N2，甲型流感/Guizhou/54/89(H3N2)；H1N1，甲型流感/PuertoRico/8/1934(H1N1)，甲型流感/Shanghai/37T/2009(H1N1)和乙型流感/Florida/4/2006。5.经酸酐处理的蛋白质和任选的另一种用于治疗和/或预防流感的药剂在制备用于预防和/或治疗受试者中的流感病毒感染的药物中的用途，其中所述经酸酐处理的蛋白质是通过将酸酐溶液与蛋白质溶液混合产生的，其中所述蛋白质选自：乳球蛋白，优选β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)，更优选牛β-乳球蛋白；白蛋白，优选牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白；RNA酶，优选RNA酶Ι；优选地，其中根据蛋白质中的精氨酸和/或赖氨酸的修饰率测定，所述经酸酐处理的蛋白质是完全酸酐化的；优选地，其中酸酐的终浓度选自3、6、12、24、36、48和60mM以上或3mM以上其他浓度，优选60mM；优选地，其中所述酸酐选自：3-羟基-邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐和马来酸酐；优选地，其中所述酸酐溶液是酸酐的二甲基亚砜溶液，优选地通过将所述酸酐的粉末溶解于二甲基亚砜获得；优选地酸酐溶液的浓度为0.5M以上，优选0.5M-10M，优选1M-5M，更优选1M；优选地，其中所述蛋白质溶液是蛋白质的磷酸盐溶液；其中优选地，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸钠和磷酸钾，优选磷酸氢二钠；其中优选地，所述磷酸盐溶液的pH大于7，例如7.5-14，8-10，或8.5-9，优选8....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨霞，陆路，姜世勃，付玉红，李佩玉，徐巍，
申请(专利权)人：山西锦波生物医药股份有限公司，复旦大学，
类型：发明
国别省市：山西,14