一种生物合成人体结构性材料的制备方法技术

本文中提供了一种生物合成人体结构性材料的制备方法。多肽具有SEQID NO.4、5或6的氨基酸序列。本发明专利技术制备得到的重组

【技术实现步骤摘要】
一种生物合成人体结构性材料的制备方法


[0001]本专利技术属于合成生物
，涉及一种人体结构性材料的生物合成制备方法。

技术介绍

[0002]人体结构性材料主要是包含胶原蛋白之内的结构性蛋白，这类蛋白对细胞、组织具有黏附、支撑功能，是主要的细胞外基质组成成分。
[0003]胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％，目前发现人体至少有28种胶原蛋白亚型，分别位于不同组织器官。其中VII型胶原蛋白属于纤维型的胶原蛋白，分布于复层鳞状上皮的基底膜区，例如：皮肤、口腔黏膜、子宫颈等，所以又称基底膜胶原蛋白。VII型胶原蛋白是皮肤中的锚定原纤维的主要组分，这些原纤维从表皮基底膜的层状树突延伸到真皮结缔组织，有助于表皮和真皮之间的粘附。有动物实验可证明，VII型胶原蛋白可通过组织层粘连蛋白，促进纤维细胞迁移和分泌细胞因子，参与皮肤的损伤和修复；也可通过人为注射重组VII型胶原蛋白纠正营养不良大疱表皮松懈症。
[0004]目前，人们主要是从动物组织提取或通过慢病毒转染得到VII型胶原蛋白粗品。遗憾的是，VII型胶原蛋白在生物体内含量较低，提取过程较为复杂，且动物源性免疫反应也是导胶原蛋白在应用中受限的重要原因。而慢病毒转染虽具有较低的免疫源性，但操作难度大和对目的基因容量有较大的限制。随着我国胶原蛋白产业的日益壮大，利用生物合成路径获得胶原蛋白日趋成熟，尤其是人源化胶原蛋白已经走在世界前列。2021年国家药监局对生物合成胶原蛋白做了命名分类，其中，重组人源化胶原蛋白是指由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。
[0005]VII型胶原蛋白是由3条相同的
ɑ
1链组成的同源三聚体，分子形式为
ɑ1ɑ1ɑ
1(VII)。三个α1(VII)链一起扭曲形成前胶原的三链绳状分子。前胶原分子由细胞分泌并通过酶处理从末端除去多余的蛋白质片段。前胶原分子在加工后，排列未长的薄束，形成成熟的VII型胶原蛋白。而每一条
ɑ
1多肽链均含有中央胶原性的三螺旋区，两侧为非胶原性的氨基端和羧基端。胶原性的结构区是由特征性Gly
‑
X
‑
Y重复序列构成三螺旋结构域。VII型胶原蛋白的基因突变，会引起胶原蛋白的合成障碍或是结构异常，导致不同程度的水疱，其症状可累及到皮肤、口腔黏膜、食道等部位。虽大多数为无义突变，但是仍会出现错义突变，导致胶原蛋白在细胞内的滞留和错误折叠，影响阴道粘膜与基底膜固有层的连接。
[0006]目前VII型胶原蛋白主要通过酶解法和慢病毒转染来得到。其中酶解法是指：通过蛋白酶处理动物来源的组织，从而提取得到VII型胶原蛋白衍生物。但是该方法提取的胶原蛋白已经丧失了原本的生物学活性，无法发挥该胶原蛋白真正的功能。而慢病毒转染是指通过构建逆转录病毒载体，再进行细胞转染，最后提纯得到VII型胶原蛋白。但是该方法的制备过程具有以下缺陷：制备难度大，不易获得高纯度的病毒；慢病毒载体在宿主基因组的整合具有随机性，可能干扰插入位点及其附近基因表达；难以实现整合拷贝数的精确控制；
目的基因的容量小。所以，亟需一种可以克服该缺陷的重组
Ⅶ
型人源化胶原蛋白的生物合成方法，使其作为人体结构性材料得到广泛应用。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的缺陷，本专利技术设计了重组VII型人源化胶原蛋白的核心功能区筛选和合成工艺。本专利技术设计了一种重组VII型人源化胶原蛋白的功能区筛选和蛋白合成工艺，属于首次专利技术。
[0008]在一方面，本专利技术提供了多肽，其包含(重复单元)
n
，该重复单元包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列，各重复单元是直接连接的并且重复单元的数目n是4
‑
20。在一个实施方案中，多肽是重组VII型人源化胶原蛋白。
[0009]在一个实施方案中，多肽具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列。
[0010]在一方面，本专利技术提供了核酸，其包含本文所述的多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸还包含编码纯化标签的核苷酸序列。纯化标签可以是His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签。在一个实施方案中，核酸还包含编码前导序列的核苷酸序列。
[0011]在一个实施方案中，核酸包含SEQ ID NO.7的核苷酸序列。
[0012]在一方面，本专利技术提供了载体，其包含本文所述的核酸。在一个实施方案中，核酸可以包含与核酸可操作连接的表达控制元件。在一个实施方案中，表达控制元件可以是启动子、终止子和/或增强子。
[0013]在一方面，本专利技术提供了宿主细胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在一个实施方案中，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞。在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，大肠杆菌是大肠杆菌BL21。
[0014]在一方面，本专利技术提供了生产根据本文所述的多肽，其包括：
[0015](1)在合适的培养条件下培养本文所述的宿主细胞；
[0016](2)收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；和
[0017](3)纯化融合蛋白。
[0018]纯化步骤可以通过选自下组的步骤进行：(1)在Ni亲和层析柱粗纯多肽；(2)添加TEV酶酶切；(3)离子交换柱精纯多肽。
[0019]在一方面，本专利技术提供了组合物，其包含本文所述的多肽、本文所述的核酸、本文所述的载体和/或本文所述的宿主细胞。例如，组合物可以包含多肽。多肽的浓度可以大于1mg/ml、大于5mg/ml、大于10mg/ml或大于12mg/ml。
[0020]在一个实施方案中，组合物是生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。
[0021]在一方面，本专利技术提供了本文所述的多肽、本文所述的核酸、本文所述的载体和/或本文所述的宿主细胞和/或本文所述的组合物在体外促进细胞黏附或者在制备促进细胞黏附的产品或试剂盒中的用途。
[0022]在一方面，本专利技术提供了本文所述的多肽、本文所述的核酸、本文所述的载体和/
或本文所述的宿主细胞和/或本文所述的组合物在高端医疗器械制备，如生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养、心血管支架、涂层、组织注射填充、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生、肝脏组织及血管修复再生、3D打印人造器官生物材料等；高端化妆品原料及药用辅料；食品添加剂中的应用。
[0023]在一方面，本专利技术提供了促进细胞增殖的方法，其包括将细胞与本文所述的多肽接触。优选地，所述细胞是动物细胞，例如哺乳动物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多肽，其包含(重复单元)
n
，该重复单元包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列，各重复单元是直接连接的并且重复单元的数目n是4
‑
20；优选地所述多肽是重组VII型人源化胶原蛋白。2.根据权利要求1所述的多肽，其中多肽具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列。3.核酸，其包含编码权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列，任选地，核酸还包含编码纯化标签，例如His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签的核苷酸序列；任选地，核酸还包含编码前导序列的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核酸，其包含SEQ ID NO.7的核苷酸序列。5.载体，其包含根据权利要求3或4所述的核酸，任选地包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件，如启动子、终止子和/或增强子。6.宿主细胞，其包含根据权利要求3或4所述的核酸或根据权利要求5所述的载体；其中优选地，宿主细胞是真核细胞或原核细胞；其中优选地，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞，和/或原核细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌BL21。7.生产根据权利要求1或2所述的多肽，其包括：(1)在合适的培养条件下培养根据权利要求6所述的宿主细胞；(2)收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；和(3)纯化融合蛋白，例如包括(1)在Ni亲和层析柱上粗纯多肽；(2)添加TEV酶酶切；(3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨霞，兰小宾，王玲玲，张永健，刘欣，宋海红，
申请(专利权)人：山西锦波生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：