一种重组人源制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种重组人源

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源III型胶原蛋白及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种重组人源
III
型胶原蛋白及其制备方法和用途
。

技术介绍

[0002]胶原
(collagen)
是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，占蛋白质总量的
25
％～
30
％，广泛存在于从低等脊椎动物的体表面到哺乳动物机体的一切组织中
。
[0003]胶原蛋白作为一种重要的天然生物蛋白，具有良好的生物相容性
、
生物活性和可降解性等独特功能特征，可广泛应用于化工
、
医药
、
食品
、
化妆品等众多领域，尤其适合制备多种生物器械，是最为理想的生物材料来源，具有广阔的应用前景
。
胶原蛋白的获得主要有两种途径，包括来源于动物组织的传统方法和异源蛋白表达
。
[0004]传统方法主要通过酸
、
碱或酶解法来处理动物来源的组织，这些方法获得的均为长度不等的混合胶原肽段，给纯化带来不便；且异源胶原蛋白在临床上表现出的排异反应，限制了其作为生物医学材料和药物载体方面的应用
。
[0005]目前，异源蛋白表达采用的宿主主要包括哺乳动物细胞
、
动物体
、
植物和微生物，微生物表达相比其他技术有着产量高
、
生产周期短
、
培养简单
、
>成本低
、
易获取高密度发酵等优点
。
目前用于重组表达人胶原蛋白的宿主菌主要有毕赤酵母
、
酿酒酵母
、
汉逊酵母
、
大肠杆菌与等
。
巴斯德毕赤酵母
(Pichia pastoris)
表达系统是一种外源蛋白表达系统，既具有原核表达系统操作简易
、
易于培养
、
生长速度快
、
表达量高
、
成本低等优点，还具有原核生物表达系统不具有的对外源蛋白的修饰如糖基化
、
蛋白磷酸化等特点
。
在过去的
20
年中已有
200
多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达，其中许多产品已被广泛应用于临床的诊断治疗和科研工作中
。
在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可实现细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，便于纯化
。
毕赤酵母发酵表达产率高
、
培养基简单
、
表达蛋白稳定且易于纯化，蛋白具有后修饰如糖基化等能力
。

技术实现思路

[0006]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种重组人源
III
型胶原蛋白及其制备方法和用途，用于解决现有技术的问题
。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种重组人源
III
型胶原蛋白，所述重组人源
III
型胶原蛋白包含如下特征的一种或多种：
[0008]1)
所述重组人源
III
型胶原蛋白包含氨基酸序列如
SEQ ID No.1
所示的多肽；
[0009]2)
如
SEQ ID No.1
具有
90
％及以上的序列一致性，以及具有
1)
限定的氨基酸序列的功能的多肽片段
。
[0010]优选地，所述重组人源
III
型胶原蛋白包含2‑6段氨基酸序列如
SEQ ID No.1
所示的肽段
。
[0011]本专利技术还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码前述重组人源
III
型胶原蛋白
。
[0012]本专利技术还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含前述多核苷酸和骨架质粒
。
[0013]本专利技术还提供一种细胞，所述宿主细胞含有前述核酸构建体或前述多核苷酸
。
[0014]本专利技术还提供前述重组人源
III
型胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包含如下步骤的一种或多种：
[0015]1)
培养前述细胞；
[0016]2)
诱导步骤
1)
中细胞目的基因表达，以获得重组人源
III
型胶原蛋白；
[0017]3)
分离
、
纯化步骤
2)
中的重组人源
III
型胶原蛋白
。
[0018]本专利技术还提供前述重组人源
III
型胶原蛋白
、
前述核酸构建体
、
前述重组人源
III
型胶原蛋白表达载体或前述细胞在制备在护肤品或组织材料中的用途
。
[0019]如上所述，本专利技术的重组人源
III
型胶原蛋白及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
[0020](1)
重组人源
III
型胶原蛋白基因同时包含天然人胶原蛋白基因的特征，其表达的蛋白将具有天然人胶原蛋白的优良特征；
(2)
在人源胶原蛋白的分子长度方面，通过制备不同重复数同向串联基因重组质粒，可在进一步的酵母表达研究中实现接近较大的分子量的天然人胶原蛋白的重组人源胶原蛋白的表达生产；
(3)
该种不同重复数同向串联基因重组质粒的制备方法，仅仅通过简单的
PCR
和同源重组转化和筛选，实现了任意重复数的目的基因
(
重组人源胶原蛋白基因
)
的串联连接；
(4)
可诱导表达的毕赤酵母工程菌能实现重组人源胶原蛋白在胞外的高水平表达，其培养易于放大，并可利用高密度发酵方式高产目的蛋白，分泌表达有利于表达产物的分离纯化，降低生产成本，且其对所表达的外源蛋白有一定的翻译后修饰功能，如糖基化等
。
附图说明
[0021]图1显示为本专利技术的重组人源
III
型胶原蛋白
PCR
串联核酸电泳检测胶图，
Line1:Marker、Line2
～
Line8:pPIC9K
‑
C
为模板
、Line9
：
pPIC9K
为模板
。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组人源
III
型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源
III
型胶原蛋白包含如下特征的一种或多种：
1)
所述重组人源
III
型胶原蛋白包含氨基酸序列如
SEQ ID No.1
所示的多肽；
2)
与
SEQ ID No.1
具有
90
％及以上的序列一致性，以及具有
1)
限定的氨基酸序列的功能的多肽片段
。2.
根据权利要求1所述的重组人源
III
型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源
III
型胶原蛋白包含2‑6段氨基酸序列如
SEQ ID No.1
所示的肽段
。3.
一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1或2所述的重组人源
III
型胶原蛋白
。4.
根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸还包含如下特征中的一种或多种：
a)
所述多核苷酸的核苷酸序列如
SEQ ID No.2
所示；
b)
与
SEQ ID No.2
具有
90
％及以上的序列一致性，以及具有
a)
限定的核苷酸序列的功能的多核苷酸
。5.
一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求3或4所述的多核苷酸和骨架质粒
。6.
根据权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述骨架质粒选自
pET
表达载体
、pCW
表达载体
、pUC
表达载体
、pAO815、pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、pPIC3.5K、pPICZ
α
A、pPICZ...

【专利技术属性】
技术研发人员：卞雨花，吴会，杨建花，庄晓新，吕祥，喻红忠，
申请(专利权)人：上海曙雅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：