一种用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白及制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，尤其涉及IPC C07K19，更具体地涉及，一种用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白及制备方法。本发明专利技术中的主要步骤为：在2

【技术实现步骤摘要】
一种用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白及制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及IPC C07K19，更具体地涉及，一种用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白及制备方法。

技术介绍

[0002]胶原蛋白(Collagen，COL)作为细胞外基质的骨架，广泛地分布在体内的各种组织中，是体内分布最广的蛋白之一，人体皮肤70％的蛋白质成分70％的组成成分为胶原蛋白。胶原蛋白对人体皮肤具有重要作用，与皮肤年轻程度、创伤修复、细胞支持、再生等行为密切相关。目前，市场上的胶原蛋白主要分为天然提取和重组两种方法，其中天然提取方法主要为水解胶原蛋白法的工艺相对成熟，利用酶水解等方法从鱼皮等生物材料中提取胶原蛋白。然而，温度和pH对这种方法的影响较大，从动物源天然提取的胶原蛋白变性温度是一般在39.5℃。当温度超过这个温度时，性能呈指数级下降，胶原蛋白受到温度和酸碱变化而马上降解为明胶，失去生物学功效。由于大部分天然提取物是由动物源制备，存在较高免疫原性，易致敏。重组胶原蛋白相对天然提取来说免疫原性低，变性温度高，纯度高。
[0003]目前COL的获得主要通过两条途径：一是从生物的组织细胞或体液中提取；二是运用基因工程技术构建表达载体，利用宿主表达重组COL。由于天然COL分子量大，全序列表达可行性低，主要是选取COL不同功能的结构域进行表达或组合表达，以获得具有不同功能的重组COL。但即使重组COL也属于大分子蛋白，无法经皮吸收。
[0004]现有专利CN202110358113.9公开了一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白及其在化妆品中的应用，该长效重组III型胶原蛋白具有可溶性、无病毒隐患和排异反应低。但其经皮吸收效果和促毛囊生长效果还有待提升。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中的问题，本专利技术第一方面提供了一种透皮吸收性高，具有毛发修护功效的PEG修饰长效重组胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0006]S1：将rhCOL蛋白原液加入到的MES(2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸)缓冲液中，然后加入EDC(碳二亚胺)溶液和胱胺于4℃反应2.5～3.5小时；
[0007]S2：反应后，加入TCEP(三(2
‑
羧乙基)膦)溶液进行还原反应，4℃反应1.5～2.5小时；
[0008]S3：还原反应后，将mPEG2
‑
MAL加入到反应体系中，于4℃反应18～22小时，即在rhCOL的C
‑
末端羧基上定点修饰上了mPEG(甲氧基
‑
聚乙二醇)，得到了PEG修饰长效重组胶原蛋白溶液；
[0009]S4：采用层析介质分离PEG修饰长效重组胶原蛋白溶液中的修饰产物，得到了用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白。
[0010]优选的，所述rhCOL蛋白原液包括rhCOL III蛋白原液或rhCOL
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蛋白原液。
[0011]优选的，所述的MES缓冲液的浓度为0.05mo1/L，pH 5.5。
[0012]优选的，所述EDC溶液的浓度为rhCOL蛋白原液的1.5～2.5倍；进一步优选的，为2倍。
[0013]优选的，所述EDC溶液中EDC和胱胺的摩尔比为(0.8～1.2)：1；进一步优选的，为1：1。
[0014]优选的，所述TCEP溶液的浓度为40～60mM。
[0015]优选的，所述的TCEP溶液中的TCEP与胱胺摩尔比(0.8～1.2)：1；进一步优选的，为1：1。
[0016]优选的，所述的mPEG2
‑
MAL的分子量为10kD。
[0017]优选的，所述mPEG2
‑
MAL与rhCOL蛋白(以蛋白含量计)的摩尔比为(3～5)：1；进一步优选的，为4：1。
[0018]优选的，所述S4中的具体步骤为：采用DEAE Sepharose FF层析介质分离PEG修饰长效重组胶原蛋白溶液中的修饰产物，PEG修饰长效重组胶原蛋白溶液用ppH6～7、8～12mmol/L磷酸盐缓冲液稀释3～7倍后上样，平衡液为pH6～7、8～12mmol/L磷酸盐缓冲液。
[0019]优选的，所述S4中的具体步骤还包括：设置DEAE Sepharose FF层析介质分离参数：0.1
‑
0.3mol/L NaCl线性梯度洗脱5CV，流速为5.0mL/min，检测波长为280nm，收集洗脱峰，超滤脱盐浓缩后获得PEG修饰长效重组胶原蛋白。
[0020]本专利技术中，选用特定修饰方法、PEG修饰剂和反应pH等条件，从而在Ⅲ型、
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型胶原蛋白的C端进行定点的修饰，得到PEG修饰长效重组胶原蛋白为均一产物、异构体少、活性保留优异，免疫原性大幅度降低。由于长效重组胶原蛋白(rhCOLⅢ和rhCOL
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)存在多个α
‑
NH2和ε
‑
NH2基团，氨基的随机修饰可能导致药物活性的明显下降，因此需要通过特定修饰方法、PEG修饰剂和反应pH等条件，在胶原蛋白的C端进行定点的修饰。本专利技术人经过一系列创造性劳动和偶然因素，在2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(pH 5.0)体系中，将长效重组III型胶原蛋白的羧基与胱胺的氨基用碳二亚胺(EDC)进行连接，控制rhCOL：胱胺：碳二亚胺的比例为1：2：2。使胱胺所携带的二硫键经三[2
‑
羧乙基]膦(TCEP)还原后，生成的巯基与PEG
‑
马来酰亚胺(mPEG
‑
MAL)反应，得到C末端羧基的选择性修饰的rhCOL，即PEG修饰长效重组胶原蛋白。本专利技术人推测，PEG具有无毒、无免疫原性、无抗原性、水溶性好等优点，长效重组III型、
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型胶原蛋白经PEG修饰后，能够提高长效重组III和
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型胶原蛋白的润滑性、保湿性、分散性、粘接性，改变长效重组III和
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型胶原蛋白的构象、静电结合、疏水性等物理化学性质，从而改善蛋白质药物的药代动力学、药效学和免疫学特性，进而增强PEG修饰长效重组III和
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型胶原蛋白的治疗效果。
[0021]本专利技术中，采用PEG定点修饰技术，对长效重组胶原蛋白的C末端羧基进行修饰，显著改善长效重组胶原蛋白的透皮效果，免疫组化试验证明修饰后的蛋白经皮能够作用到毛囊。胶原蛋白属于生物大分子，存在无法经皮吸收和无法进入毛囊等缺陷。目前FDA批准的已经上市的PEG化新药多数为随机修饰的产物，随机修饰蛋白质多以赖氨酸的ε
‑
NH2或α
‑
NH2为修饰目标，由于赖氨酸在蛋白质内通常数量较多，这种修饰引起蛋白质中多个赖氨酸被修饰，得到的产物是聚乙二醇化修饰异构体的混合物。本专利技术人创造性地在酿酒酵母表达长效重组胶原蛋白上进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将rhCOL蛋白原液加入到的MES缓冲液中，然后加入EDC溶液和胱胺于4℃反应2.5～3.5小时；S2：反应后，加入TCEP溶液进行还原反应，4℃反应1.5～2.5小时；S3：还原反应后，将mPEG2
‑
MAL加入到反应体系中，于4℃反应18～22小时，即在rhCOL的C
‑
末端羧基上定点修饰上了mPEG，得到了PEG修饰长效重组胶原蛋白溶液；S4：采用层析介质分离PEG修饰长效重组胶原蛋白溶液中的修饰产物，得到了用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白。2.根据权利要求1所述的用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述rhCOL蛋白原液包括rhCOL III蛋白原液或rhCOL
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蛋白原液。3.根据权利要求1所述的用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述EDC溶液中的EDC和胱胺的摩尔比为(0.8～1.2)：1。4.根据权利要求1所述的用于头皮修护的PEG修饰长效重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述TCEP溶液的浓度为40～60mM。5.根据权利要求1所述的用于头皮修护的PEG修饰长...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红叶，许高涛，赵俊，张艳，
申请(专利权)人：博汇美萃生物工程技术广东有限公司，
类型：发明
国别省市：