【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物，具体涉及能广谱地抑制人类冠状病毒感染的多肽及其生物合成方法。
技术介绍
1、人类冠状病毒的存在为人类的生存与健康带来了严重的威胁，给全球的经济发展带来了严重的影响。另外，现已发现一些类sars病毒，与sars-cov的基因序列高度相似，且同样具有感染人类的潜力，但是现有的sars-cov的特异性针对抗体药物对其并没有抑制作用。因而，这类病毒的存在，同样为人类的生存与健康带来严重的隐患。
2、目前，有关该类病毒的抑制剂研发主要针对s1区域和s2区域两个靶点。其中针对于s1区域的进入抑制剂以抗体为主，虽然这类抗体对特定的病毒有很好的中和活性，但对于类sars病毒并没有交叉保护的效果。而靶向于s2区域的进入抑制剂以多肽类药物为主，但目前相关抑制剂的设计方案中，仅仅基于病毒自身的的hr2的氨基酸序列或六螺旋结构而设计，尚缺乏广谱性的设计理念，因而目前所报道的人冠状病毒多肽类抑制剂往往缺乏广谱的抗病毒效果。
3、专利cn 107022008 b采用化学合成法制备得到hcov-ek系列，且研究表明hcov-ek系列多肽有非常广谱并高效的抗病毒活性，可对2种以上的人冠状病毒有很好的抑制效果。所述的广谱多肽类进入抑制剂的抗病毒机制主要是通过与病毒的hr1区域结合，干扰病毒自身六螺旋的形成，从而抑制病毒的融合进入过程。
4、目前的多肽的合成主要有两种途径：化学合成和生物合成。化学合成主要是通过氨基酸脱水缩合反应。根据是否使用固相载体树脂可分为固相合成和液相合成。液相合成有两种策略，逐步合
5、生物合成法主要包括酶解法、酶催化法、发酵法和基因工程法。酶解法是指利用生物酶降解大分子动物或植物蛋白，获得小分子肽。但该方法因其产量低、污染加大、产品质量不稳定等原因难以实现工业化生产。发酵法是利用微生物代谢获得多肽。虽具有成本低的优势，但难以通过特定微生物发酵获得特定多肽。酶催化法因具有活性高、专一性强的特点十分适合多肽序列的合成。具有绿色环保、产业化成本低廉等优势，但同样存在研发难度大、周期长等缺陷。基因工程法是基于dna重组技术，通过dna序列来控制多肽序列的生产。其方法具有定点性强、生产成本低、安全环保等优势，但该方法同样面临研发与生产设备投入大、研发周期长、无法表达天然氨基酸等缺陷。
6、基于现有技术的现状，本领域中需要新的生物合成方法。
技术实现思路
1、专利技术人发现在大肠杆菌的重组表达过程中短多肽存在不能表达或不能充分表达的技术问题，因此针对每种多肽，需要进行实验表明该多肽是否可以重组表达。先前发现seq id no:1所示的多肽具有抗病毒活性。然而，该多肽是通过化学合成制备的。现有技术中未报告过通过微生物发酵产生该多肽的尝试。对此，专利技术人进行了大量工作，通过选择合适的编码序列seq id no:2，并且通过使用合适的发酵和纯化工艺，通过微生物发酵制备了seq id no:1所示的多肽。
2、在一个方面，本专利技术提供了多核苷酸，其编码seq id no:1所示的多肽，该多核苷酸包含seq id no:2所示的核苷酸序列。
3、在一个方面，本专利技术提供了载体，其包含本文所述的多核苷酸。
4、在一个实施方案中，多核苷酸的5’端与tev蛋白酶切位点的核苷酸序列连接(例如直接连接)，构成插入盒。
5、在一个实施方案中，tev蛋白酶切位点具有enlyfq的氨基酸序列。
6、在一个实施方案中，载体包含n端6x his标签、凝血酶酶切位点、c端6xhis标签、trxa位点、肠激酶酶切位点和s标签中的一个或多个。
7、在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，载体是pet-32a(+)载体。
8、在一个实施方案中，插入盒以kpn i和xho i位点插入载体。
9、在一个方面，本专利技术提供了宿主细胞，其包含本文所述的载体。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在一个实施方案中，大肠杆菌是大肠杆菌bl21(de3)。
10、在一个方面，本专利技术提供了组合物，其包含本文所述的多核苷酸、载体和宿主细胞。在一个实施方案中，组合物是试剂盒。
11、在一方面，本专利技术提供了通过发酵生产多肽的方法，其中多肽为seq id no:1所示的多肽，所述方法包括将本文的宿主细胞在适合于培养该宿主细胞的条件下发酵以在上清液或菌体中收集多肽。
12、在一方面，本专利技术提供了通过发酵生产seq id no:1的多肽的方法，所述方法包括将宿主细胞在适合于培养该宿主细胞的条件下发酵，以在培养上清液或宿主细胞中收集多肽，所述宿主细胞是原核生物宿主细胞并且包含seq id no:2的多核苷酸。
13、在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞，所述方法包括以下一个或多个步骤：
14、(1)将大肠杆菌细胞在lb培养基中培养以得到种子液；
15、(2)将种子液放大培养适当的时间，并且进行诱导培养；
16、(3)收集大肠杆菌菌体并且裂解，对裂解液进行分离以得到上清液和沉淀物；
17、(4)将上清液进行柱分离，收集多肽；和
18、(5)对多肽进行酶切以消除与多肽连接的标签。
19、在一个实施方案中，步骤(1)包括将大肠杆菌细胞在lb培养基中于35～38℃，优选37℃培养6-20小时，优选8-16小时以得到种子液。
20、在一个实施方案中，步骤(2)包括将放大培养基与种子液的比例为10:1-200:1，优选50:1-150:1，更优选80-120:1将种子液添加到放大培养基中，优选地放大培养基为lb培养基；于35～38℃，优选37℃培养6-10小时，优选7-8小时；加入iptg进行诱导，iptg的浓度为0.2-1mm，优选0.3-8mm，优选0.5mm，降温至10-20℃，优选12-18℃，优选16℃，诱导培养6-20小时，优选8-16小时，并且收集菌体。
21、在一个实施方案中，步骤(3)包括将菌体重悬于缓冲液，降温至≤15℃，进行均质处理，优选高压均质处理以得到均质液，将均质液分离成上清液和沉淀物，例如通过离心分离。
22、在一个实施方案中，步骤(4)包括用平衡液平衡柱材，将上清液加入柱材，用洗杂液洗杂，并且用洗脱液洗本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.通过发酵生产SEQ ID NO:1的多肽的方法，所述方法包括将宿主细胞在适合于培养该宿主细胞的条件下发酵，以在培养上清液或宿主细胞中收集多肽，所述宿主细胞是原核生物宿主细胞并且包含SEQ ID NO:2的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞，优选是大肠杆菌BL21(DE3)，所述方法包括以下一个或多个步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(1)包括将大肠杆菌细胞在LB培养基中于35～38℃，优选37℃培养6-20小时，优选8-16小时以得到种子液，
4.根据权利要求3所述的方法，其中平衡液和/或洗杂液包含100-400mM，例如200-300mM氯化钠，10-50mM，例如20-40mM Tris和10-50mM例如20-40mM咪唑；洗脱液包含100-400mM，例如200-300mM氯化钠，10-50mM，例如20-40mM Tris和100-500mM例如200-400mM咪唑。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其还包括对包含多肽的培养上清液或裂解物或洗脱液进行反相柱层析的
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中宿主细胞包含载体，其包含SEQ ID NO:2的多核苷酸，优选地，其中所述多核苷酸的5’端与TEV蛋白酶切位点的核苷酸序列连接，构成插入盒；优选地，TEV蛋白酶切位点具有ENLYFQ的氨基酸序列；优选地，载体包含N端6xHis标签、凝血酶酶切位点、C端6xHis标签、TrxA位点、肠激酶酶切位点和S标签中的一个或多个；优选地，载体是表达载体，优选是pET-32a(+)表达载体；优选地，插入盒以Kpn I和XhoI位点插入载体。
7.抑制冠状病毒的体外方法，其包括应用SEQ ID NO:1的多肽或包含该多肽的组合物，该多肽的N末端氨基酸残基不含乙酰基和/或C末端氨基酸残基不含酰胺基，或者N末端氨基酸残基未进行乙酰化和/或C末端氨基酸残基未进行酰胺化；或者该多肽是原核生物宿主细胞表达的多肽或者不是化学合成的多肽，其中所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、Rs3367-CoV、WIV1-CoV、MERS-CoV和HCoV-229E；优选地，SARS-CoV-2选自BA.2、BA.2.75、BA.2.86、XBB.1.5和EG.5变异株；优选地，对被冠状病毒感染或有风险被冠状病毒感染的细胞应用多肽或包含该多肽的组合物或使多肽或包含该多肽的组合物与冠状病毒接触；优选地，多肽是通过权利要求1-6中任一项的方法制备的多肽；优选地，组合物还包含用于抑制冠状病毒或治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药剂，优选选自下组：法匹拉韦、奈非那韦、阿比朵尔、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、达芦那韦或瑞德西韦；优选地，所述组合物包含药学可接受的载体。
8.SEQ ID NO:1的多肽或包含该多肽的组合物在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于预防或治疗受试者中的冠状病毒感染或由冠状病毒引起的疾病，该多肽的N末端氨基酸残基不含乙酰基和/或C末端氨基酸残基不含酰胺基，或者N末端氨基酸残基未进行乙酰化和/或C末端氨基酸残基未进行酰胺化；或者该多肽是原核生物宿主细胞表达的多肽或者不是化学合成的多肽，其中所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、Rs3367-CoV、WIV1-CoV、MERS-CoV和HCoV-229E；优选地，SARS-CoV-2选自BA.2、BA.2.75、BA.2.86、XBB.1.5和EG.5变异株；优选地，多肽是通过权利要求1-6中任一项的方法制备的多肽；优选地，其中所述药物的剂型是片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉针剂；优选地，组合物还包含用于抑制冠状病毒或治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药剂，优选选自下组：法匹拉韦、奈非那韦、阿比朵尔、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、达芦那韦或瑞德西韦；优选地，所述组合物包含药学可接受的载体；其中所述药物优选通过以下方式给药：注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等，腔道给药，如经直肠、阴道和舌下，呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药，或者表面给药。
...【技术特征摘要】
1.通过发酵生产seq id no:1的多肽的方法，所述方法包括将宿主细胞在适合于培养该宿主细胞的条件下发酵，以在培养上清液或宿主细胞中收集多肽，所述宿主细胞是原核生物宿主细胞并且包含seq id no:2的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞，优选是大肠杆菌bl21(de3)，所述方法包括以下一个或多个步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(1)包括将大肠杆菌细胞在lb培养基中于35～38℃，优选37℃培养6-20小时，优选8-16小时以得到种子液，
4.根据权利要求3所述的方法，其中平衡液和/或洗杂液包含100-400mm，例如200-300mm氯化钠，10-50mm，例如20-40mm tris和10-50mm例如20-40mm咪唑；洗脱液包含100-400mm，例如200-300mm氯化钠，10-50mm，例如20-40mm tris和100-500mm例如200-400mm咪唑。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其还包括对包含多肽的培养上清液或裂解物或洗脱液进行反相柱层析的步骤，优选地反相柱使用具有以下性质的填料：
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中宿主细胞包含载体，其包含seq id no:2的多核苷酸，优选地，其中所述多核苷酸的5’端与tev蛋白酶切位点的核苷酸序列连接，构成插入盒；优选地，tev蛋白酶切位点具有enlyfq的氨基酸序列；优选地，载体包含n端6xhis标签、凝血酶酶切位点、c端6xhis标签、trxa位点、肠激酶酶切位点和s标签中的一个或多个；优选地，载体是表达载体，优选是pet-32a(+)表达载体；优选地，插入盒以kpn i和xhoi位点插入载体。
7.抑制冠状病毒的体外方法，其包括应用seq id no:1的多肽或包含该多肽的组合物，该多肽的n末端氨基酸残基不含乙酰基和/或c末端氨基酸残基不含酰胺基，或者n末端氨基酸残基未进行乙酰化和/或c末端氨基酸残基未进行酰胺化；或者该多肽是原核生物宿主细胞表达的多肽或者不是化学...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆路，姜世勃，夏帅，王李珏，王茜，杨霞，何振瑞，张永健，刘增耀，王颖，兰小宾，王玲玲，
申请(专利权)人：山西锦波生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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