一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于聚合酶协助反馈滚环扩增和内切酶放大荧光法检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器。为了解决以上现有技术中检测UDG的方法特异性和灵敏度都比较低的问题。一种基于反馈滚环扩增技术检测UDG的生物传感器，将phi29聚合酶、核酸内切酶IV的配合实现滚环放大作用，以及荧光基团与猝灭基团的荧光共振能量转移，均相反应混合液。制备方法：环形模板及复合探针的构建；反馈滚环放大信号、荧光检测；利用了UDG酶对碱基U的特异性水解，利用这种特殊反应可以精准地测定UDG，同时还可以避免干扰的发生；利用核酸内切酶Ⅳ循环放大，实现信号放大的作用。

A fluorescent biosensor for detecting DNA glycosylase UDG and its preparation method

The invention relates to the technical field of biosensors, in particular to a fluorescent biosensor for detecting DNA glycosylase UDG based on polymerase-assisted feedback ring amplification and endonuclease amplification fluorescence method. In order to solve the problem that the specificity and sensitivity of UDG detection methods in the above existing technologies are relatively low. A biosensor for UDG detection based on feedback rolling amplification technique was developed. The combination of phi29 polymerase and endonuclease IV was used to realize rolling amplification and fluorescence resonance energy transfer between fluorescent group and quenching group. The mixed solution was homogeneously reacted. Preparation methods: construction of ring template and composite probe; feedback ring amplification signal and fluorescence detection; specific hydrolysis of base U by UDG enzyme, which can accurately determine UDG and avoid interference; amplification of signal by nucleic acid endonuclease IV cycle.

【技术实现步骤摘要】
一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器及其制备方法
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及基于反馈滚环扩增和核酸内切酶信号放大的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
DNA糖基化酶UDG是一种重要的碱基切除修复酶，负责修复由尿嘧啶引起的DNA损伤和维护基因组的完整性，同时UDG的异常表达也与多种癌症相关联。水解胞嘧啶生成尿嘧啶是DNA水解损伤中最常见的一种形式，从而导致在DNA复制过程中G：C碱基对转变成A：U碱基对。UDG作为碱基切除修复路径的启动者和“巡逻兵”，具有对尿嘧啶的高特异性，因此可作用于识别和催化单链或双链DNA上的N-糖苷键的水解和分裂。随后，释放了受损的碱基并产生了一种无嘌呤无嘧啶的位点（即AP位点）并触发DNA修复过程，并通过附加的AP内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶的协调作用来移除AP位点，以取代正常的胞嘧啶碱基。其结果是在DNA损伤修复和连接中，酶对于碱基切除修复酶的活性是与人体疾病具有一定的相关性。异常的UDG作用可以诱发基因突变与多种疾病直接相关包括癌症，基因型疾病，人类免疫缺陷。碱基切除修复酶活性的研究对了解DNA损伤修复的生理反应呈现出关键性生物学意义。因此，UDG作为一种潜在的生物标志物，进行高灵敏、高选择性检测对其基础功能研究和临床诊断都具有重要意义。经典的UDG活性检测方法主要有放射性标记法、凝胶电泳法、质谱分析法。以上方法短板在于耗费时间、灵敏度较低、并且需要对样品进行预处理。
技术实现思路
为了解决现有技术中检测UDG的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的，基于聚合酶协助反馈滚环扩增和内切酶放大荧光法检测DNA糖基化酶UDG的生物传感器，同时还提供了其制备方法。一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器，包括目标物UDG、复合探针I、复合探针II、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP、10×buffer缓冲液；所述的复合探针I由U-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；所述的复合探针II由S-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；所述的环状模板由线性挂锁探针C-DNA与连接探针L-DNA结合，在T4DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板；所述的碱基序列如下：U-DNA序列如SEQNo.1所示；线性挂锁探针C-DNA序列如SEQNo.2所示；连接探针L-DNA序列如SEQNo.3所示；S-DNA序列如SEQNo.4所示；所述的U-DNA的5’端第41和42位碱基之间有个修饰位点U，代表尿嘧啶碱基；U-DNA的3’端修饰InverteddT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用；所述的C-DNA中的5’端修饰磷酸基团；所述的S-DNA的5’端第41和42位碱基之间修饰了Dabcyl淬灭基团，然后还有个四氢呋喃修饰位点，即无嘌呤无嘧啶位点；第45和46位碱基之间有修饰了FAM荧光基团；3’端修饰的InverteddT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）环形模板构建；（2）复合探针I、复合探针II的制备；（3）均相反应；（4）荧光检测：荧光仪设置激发波长为486nm，检测518nm处荧光强度，检测范围为450nm-530nm。所述步骤（1）具体工艺为：S1将C-DNA和L-DNA6加入到EP管中，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温；随后放入到16℃水浴中，过夜反应；S2然后在反应体系里添加T4DNA连接酶，将其在16℃下反应20h；S3灭活体系中的T4DNA连接酶；S4向上述反应体系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，37℃下反应2h；再将反应体系85℃水浴加热10min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。所述的步骤（2）中复合探针I的制备工艺为：将灭菌水、环形模板、U-DNA、PBS缓冲液加入到EP管中，在37℃孵育40min，使环形模板与U-DNA充分杂交，制备成复合探针I。所述的步骤（2）中复合探针II的制备工艺为：将环形模板、灭菌水、PBS缓冲液、S-DNA在37℃孵育40min制备成复合探针II。所述步骤（3）具体工艺为：将灭菌水，10×buffer缓冲液、复合探针I、复合探针II、UDG、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP加入EP管中，在37℃下，孵育2h。所述的10×buffer缓冲液为：50mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mMDTT；pH7.5。本专利技术中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：U-DNA:CACACGAATTCATCTGTTTTTTTTTTTTACTCTTCCTAGCTUGACTTGCCGGACTTTAGTCAAGCTATTTTT-InverteddT线性挂锁探针C-DNA(circularDNA):p-ATTCGTGTGATAGCTTACATGGCAGAGACTGGATAGCTTACATGGCCAGATGA连接探针L-DNA(ligationDNA):CACACGAATTCATCTGTS-DNA(signalDNA):CACACGAATTCATCTGTTTTTTTTTTTTACTCTTCCTAGCT(Dabcyl)XACAT(FAM)GGC-InverteddT其中在U-DNA中以红色突出显示的表示尿嘧啶脱氧核糖核苷的修饰位点，斜体的部分则是与环形模板的互补序列，3’端修饰的InverteddT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。在C-DNA中的p表示一个5’磷酸基团的修饰，用于在T4DNA连接酶的作用下，与3’端的羟基形成磷酸二酯键，构成环形模板，而下划线区域表示与L-DNA的结合区域。S-DNA中斜体部分表示能与环状模板的结合序列，分别在两个碱基T上修饰了FAM荧光基团和Dabcyl淬灭基团，X表示四氢呋喃位点（dSpacer）修饰，即无嘌呤无嘧啶位点（AP位点）。3’端修饰的InverteddT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。本专利技术中UDG的检测是在均相溶液中实现的，通过phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV的配合实现双重信号放大，从而实现UDG的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。（二）均相中发生的反应主要有：环形模板及复合物探针的制备；含有碱基U的复合探针对目标物的识别过程；基于phi29DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性的反馈滚环扩增反应。（1）环形模板及复合探针的制备。线性挂锁探针C-DNA与连接探针L-DNA结合，在T4DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板备用。在含有碱基U修饰的U-DNA能够与制备好的环状模板通过碱基互补配对结合形成复合探针I；而S-DNA能够与制备好的环状模板结合形成复合探针II。（2）目标物UDG识别复合探针上的尿嘧啶产生水解作用。当有目标物存在时，UDG能够识别预先修饰有尿嘧啶的复合探针I并对糖苷键进行水解作用，随后产生一个无嘌呤无嘧啶的AP位点。随后，核酸内切酶IV识别AP位点并进行切割使复合探针断裂，在有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器，其特征在于，包括目标物UDG、复合探针I、复合探针II、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP、10×buffer缓冲液；所述的复合探针I由U‑DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；所述的复合探针II由S‑DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；所述的环状模板由线性挂锁探针C‑DNA与连接探针L‑DNA结合，在T4 DNA连接酶的作用下，形成环形模板‑连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板；所述的碱基序列如下：U‑DNA序列如SEQ No.1所示；线性挂锁探针C‑DNA序列如SEQ No.2所示；连接探针L‑DNA序列如SEQ No.3所示；S‑DNA序列如SEQ No.4所示；所述的U‑DNA的5’端第41和42位碱基之间有个修饰位点U，代表尿嘧啶碱基；U‑DNA的3’端修饰Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用；所述的C‑DNA中的5’端修饰磷酸基团；所述的S‑DNA的5’端第41和42位碱基之间修饰了Dabcyl淬灭基团，然后还有个四氢呋喃修饰位点，即无嘌呤无嘧啶位点；第45和46位碱基之间有修饰了FAM荧光基团；3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。...

【技术特征摘要】
1.一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器，其特征在于，包括目标物UDG、复合探针I、复合探针II、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP、10×buffer缓冲液；所述的复合探针I由U-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；所述的复合探针II由S-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；所述的环状模板由线性挂锁探针C-DNA与连接探针L-DNA结合，在T4DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板；所述的碱基序列如下：U-DNA序列如SEQNo.1所示；线性挂锁探针C-DNA序列如SEQNo.2所示；连接探针L-DNA序列如SEQNo.3所示；S-DNA序列如SEQNo.4所示；所述的U-DNA的5’端第41和42位碱基之间有个修饰位点U，代表尿嘧啶碱基；U-DNA的3’端修饰InverteddT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用；所述的C-DNA中的5’端修饰磷酸基团；所述的S-DNA的5’端第41和42位碱基之间修饰了Dabcyl淬灭基团，然后还有个四氢呋喃修饰位点，即无嘌呤无嘧啶位点；第45和46位碱基之间有修饰了FAM荧光基团；3’端修饰的InverteddT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。2.权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）环形模板构建；（2）复合探针I、复合探针II的制备；（3）均相反应；（4）荧光检测：荧光仪设置激发波长为...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，王敬锋，刘素，王玉，宋晓蕾，张雪，王海旺，赵一菡，瞿晓南，张儒峰，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37