一种金针菇菌丝核相的观察方法技术

本发明专利技术提供了一种金针菇菌丝核相的观察方法，涉及生物组织学领域，其包括如下依次进行的步骤：DAPI染色步骤：采用DAPI染色液对附着在盖玻片上的金针菇菌丝进行DAPI染色；VBL染色步骤：采用VBL染色液对经DAPI染色后的金针菇菌丝进行VBL染色。本发明专利技术提供了一种金针菇菌丝核相的观察方法，该方法能快速清晰的获得金针菇菌丝细胞核与细胞壁结构图像。

A Method for Observing the Mycelial Phase of Flammulina velutipes

The invention provides a method for observing the nucleus phase of Flammulina velutipes mycelium, which relates to the field of biohistology. It includes the following steps: DAPI dyeing steps: DAPI dyeing steps: using DAPI dyeing solution to dye the Flammulina velutipes mycelium attached to the cover slide; and VBL dyeing steps: using VBL dyeing solution to dye the Flammulina velutipes mycelium after DAPI dyeing by VBL. The invention provides a method for observing the mycelial nucleus phase of Flammulina velutipes, which can quickly and clearly obtain the image of the mycelial nucleus and cell wall structure of Flammulina velutipes.

【技术实现步骤摘要】
一种金针菇菌丝核相的观察方法
本专利技术涉及生物组织学领域领域，具体而言，涉及一种金针菇菌丝核相的观察方法。
技术介绍
金针菇(Flammulinavelutipes)是我国重要的少数实现大规模工厂化栽培的食用菌之一。金针菇味道鲜美，营养丰富，又被称之为增智菇。菌丝是金针菇的结构单位，也是其营养生长的主要模式。菌丝形态是反应金针菇生长情况最直观的参考依据，其中菌丝内细胞核的核相变化又是金针菇菌丝生长状态的重要依据。在菌丝细胞核研究中，一般认为细胞壁与细胞核共同组成菌丝细胞的基本观察单元，因此在金针菇菌丝核相观察中，同时观察到细胞壁和细胞核才能更加严谨的对观察结果进行表述。但在目前的金针菇菌丝核相观察中，一般菌丝细胞核都被清晰的展示，但细胞核两端的细胞壁结构缺未体现或图像较模糊，并不能很好的说明实验结果。此外，现有的技术检测时间长，科研人员耗时成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种金针菇菌丝核相的观察方法，该方法能快速的获得高清晰度的金针菇菌丝细胞核和细胞壁结构图像。本专利技术是这样实现的：一种金针菇菌丝核相的观察方法，其包括如下依次进行的步骤：DAPI染色步骤：采用DAPI染色液对附着在盖玻片上的金针菇菌丝进行DAPI染色；VBL染色步骤：采用VBL染色液对经DAPI染色后的金针菇菌丝进行VBL染色。在本专利技术较佳的实施例中，在DAPI染色步骤中，将盖玻片置于冰浴条件(-4℃-8℃)下进行染色；优选的，在DAPI染色步骤中，DAPI染色时间为15-25min。在本专利技术较佳的实施例中，在DAPI染色步骤中，所用的DAPI染色液中的DAPI的浓度为0.8μg/mL～1.2μg/mL，DAPI染色液的滴加量为180μL-220μL；优选的，在DAPI染色步骤中，所用的DAPI染色液中的DAPI的浓度为1μg/mL，DAPI染色液的滴加量为200μL。在本专利技术较佳的实施例中，在VBL染色步骤中，将盖玻片置于室温(15℃-30℃)条件进行VBL染色；优选的，在VBL染色步骤中，VBL染色时间为3-6min。在本专利技术较佳的实施例中，在VBL染色步骤中，所用的VBL染色液的浓度为0.001‰～0.01‰，VBL染色液的滴加量为180μL-220μL；优选的，在VBL染色步骤中，所用的VBL染色液中的VBL染色液的浓度为0.001‰，VBL染色液的滴加量为200μL。在本专利技术较佳的实施例中，在VBL染色步骤之后，上述方法还包括洗涤步骤；洗涤步骤包括：用PBS缓冲液或水冲洗附着在盖玻片上的金针菇菌丝；优选的，冲洗的次数为1-5次，每次冲洗的时间为1-5min；优选的，冲洗的次数为3次，第一次冲洗的时间为5min，第二次冲洗的时间为3min，第三次冲洗的时间为1min。在本专利技术较佳的实施例中，在洗涤步骤后，上述方法还包括封片步骤和观察步骤；封片步骤包括：在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片。在本专利技术较佳的实施例中，在封片步骤后，还包括观察步骤，观察步骤包括：将封片后的载玻片置于荧光显微镜下进行观察。在本专利技术较佳的实施例中，在DAPI染色步骤之前，上述方法还包括插片步骤：将盖玻片与长有金针菇菌落的培养基平面呈锐角的角度插入至培养基中；优选的，锐角为45度。盖玻片在使用前，需要进行干热灭菌处理。优选的，于180℃烘箱中干热灭菌2h。在本专利技术较佳的实施例中，在DAPI染色步骤之前，上述方法还包括爬片步骤；爬片步骤包括：将插有盖玻片的培养基置于20-30℃条件下避光培养3-4d以使金针菇菌丝附着在盖玻片上。本专利技术的有益效果包括：本专利技术提供的金针菇菌丝核相的观察方法，该方法可操作性强、可重复性高、稳定可靠，采用该方法观察金针菇菌丝的结果荧光信号强、质量高、效果好，可同时获得组织结构清晰的金针菇菌丝细胞核和细胞壁结构图像。该方法不仅可用于研究、观察金针菇菌丝核相变化，也为金针菇生理、遗传和形态学研究提供严谨可靠方法，还可广泛应用于其它大型真菌组织荧光观察实验中,具有较好的科研应用前景。此外，该方法快捷，为科研人员节约了检测时间，从而加快了研发效率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为金针菇菌丝的快速检测方法主要操作图示(A插片；B爬片；C菌丝爬片后的盖玻片；D染色；E.荧光显微镜观察)；图2为金针菇菌丝染色后的显微图像(采用10x目镜、100x物镜。A-D为经本专利技术提供的方法染色后用蔡司Axioobserver荧光显微镜拍摄的金针菇菌丝细胞结构，A、C和D为金针菇菌丝细胞壁及细胞核结构，B为锁状联合结构；a为菌丝内细胞壁，b为细胞核，c为锁状联合内细胞壁)；图3为实施例2盖玻片经染色后用蒸馏水进行洗涤获得的显微图像(a为细胞壁结构，b为细胞核结构)；图4为对比例1现有技术中金针菇菌丝染色后显微图像(A和B为采用菌丝细胞壁与细胞核分开染色方法获得图像，其中a为细胞壁结构，b为细胞核结构；c为只对菌丝细胞核染色获得的图像)；图5为对比例2、对比例3和对比例4中金针菇菌丝显微图像(A为对比例2的显微图像；B为对比例3的显微图像；C为对比例4的显微图像，其中a为细胞壁结构，b为细胞核结构)。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的金针菇菌丝核相的观察方法，包括依次进行的如下步骤(流程参考图1)：(1)取洁净的盖玻片，在180℃烘箱中干热灭菌2h；(2)插片：选取在培养皿培养3天的金针菇菌落，将盖玻片与长有金针菇菌落的培养基平面呈45度插入至培养基中；(3)爬片：将插过盖玻片的培养基于25℃避光培养3d，待菌丝生长并漫过大部分盖玻片；(4)DAPI染色步骤：向经步骤(3)处理后的附着有菌丝的盖玻片滴加200μL的1μg/mlDAPI染色液(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，4'，6-diamidino-2-phenylindole)，在冰浴(将盖玻片置于冰上即可)中染色20min；(5)VBL染色步骤：向经步骤(4)DAPI染色后的盖玻片滴加200μL的0.001‰的VBL染色液(4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐)，在室温25℃下进行染色5min；(6)洗涤：将盖玻片用PBS缓冲液冲洗3次，洗涤时间分别为5min，3min和1min；(7)封片：取洁净的载玻片，在载玻片上滴加封片剂，用盖玻片封片；(8)观察：将封片后的载玻片置于蔡司Axioobserver荧光显微镜下，使用10×目镜，100×物镜，于紫外光下观察。结果参照图2所示，A-D为经本专利技术提供的方法染色后用蔡司Axioobserver荧光显微镜拍摄的金针菇菌丝细胞结构，A、C和D为金针菇菌丝细胞壁及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金针菇菌丝核相的观察方法，其特征在于，其包括如下依次进行的步骤：DAPI染色步骤：采用DAPI染色液对附着在盖玻片上的金针菇菌丝进行DAPI染色；VBL染色步骤：采用VBL染色液对经DAPI染色后的金针菇菌丝进行VBL染色。

【技术特征摘要】
1.一种金针菇菌丝核相的观察方法，其特征在于，其包括如下依次进行的步骤：DAPI染色步骤：采用DAPI染色液对附着在盖玻片上的金针菇菌丝进行DAPI染色；VBL染色步骤：采用VBL染色液对经DAPI染色后的金针菇菌丝进行VBL染色。2.根据权利要求1所述的金针菇菌丝核相的观察方法，其特征在于，在所述DAPI染色步骤中，将盖玻片置于冰浴条件下进行染色；优选的，在所述DAPI染色步骤中，DAPI染色时间为15-25min。3.根据权利要求2所述的金针菇菌丝核相的观察方法，其特征在于，在所述DAPI染色步骤中，所用的DAPI染色液中的DAPI的浓度为0.8μg/mL～1.2μg/mL，DAPI染色液的滴加量为180μL-220μL；优选的，在所述DAPI染色步骤中，所用的DAPI染色液中的DAPI的浓度为1μg/mL，DAPI染色液的滴加量为200μL。4.根据权利要求1-3任一项所述的金针菇菌丝核相的观察方法，其特征在于，在所述VBL染色步骤中，将盖玻片置于室温条件进行VBL染色；优选的，在所述VBL染色步骤中，VBL染色时间为3-6min。5.根据权利要求4所述的金针菇菌丝核相的观察方法，其特征在于，在所述VBL染色步骤中，所用的VBL染色液的浓度为0.001‰～0.01‰，VBL染色液的滴加量为180μL-220μL；优选的，在所述VBL染色步骤中，所用的VBL染色液中的VB...

【专利技术属性】
技术研发人员：万佳宁，王瑞娟，尚晓冬，鲍大鹏，周陈力，章炉军，徐珍，张美彦，张丹，刘建雨，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31