一种高通量检测双磷脂的方法技术

本申请公开一种高通量检测双磷脂的方法，所述方法包括：将双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品分别衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述双磷脂和所述磷脂酰甘油标准品进行分离、检测，建立关于所述双磷脂的高通量液相色谱串联质谱数据库；将样品衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述样品进行分离、检测，获得所述样品的双磷脂特征性离子；将获得的所述双磷脂特征性离子在所述高通量液相色谱串联质谱数据库中进行搜索，获得所述样品中关于所述双磷脂的信息。本申请通过建立高分辨数据库，可实现对BMP的高通量分析，而衍生化方法不仅提高了BMP的信号强度，而且降低了同分异构体的干扰，提高了数据分析结果的准确性以及数据分析结果的可重复性。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测双磷脂的方法
本申请涉及分析化学领域，尤其但不限于涉及一种基于超高效液相色谱/高分辨质谱进行高通量检测双磷脂的方法。
技术介绍
双磷脂Bis(monoacylglycero)phosphate(BMP)和磷脂酰甘油phosphatidylglycerol(PG)是结构上的同分异构体，但在生物体内有着不同的生物功能。PG是一类酸性磷脂并且是细胞膜的重要组成成分；BMP是一类靶向于晚期胞内体和溶酶体的内膜上，常被用于检测这些细胞器的标志物。BMP的独特结构使它能够抵抗大多数磷脂酶的降解，研究结果表明BMP的升高与多种疾病有着密切的关系。因此，越来越多的人关注BMP和疾病的关系。BMP类物质的代谢轮廓分析对研究人生命科学、疾病的进程等都有重要的研究意义。BMP和PG的结构式如下，两者互为同分异构体，在缺少标准品的情况下色谱上很难区分开，正离子模式的二级碎片缺少脂肪酸链信息无法进一步定性，负离子模式虽然有脂肪酸链的信息，但二级碎片信息一致很难将其区分开。BMP的疏水端倾向于连接多不饱和脂肪酸，而PG更倾向于连接饱和或者单不饱和脂肪酸，但生物样本中脂肪酸链和双键数的组合使BMP的检测变得更加复杂。然而，迄今为止还没有基于液相色谱质谱联用(liquidChromatographMassSpectrometry，LC-MS)高通量BMP分析的报道。
技术实现思路
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。本申请提供了一种在液相色谱串联质谱仪上进行高通量检测BMP的方法，首先建立关于BMP的高通量液相色谱串联质谱数据库，然后通过将待测样品衍生化，样品中的BMP和PG的二级碎片显示出差异达到特异性鉴定BMP的方法，从而可以实现复杂样本中BMP的高通量检测。具体地，本申请提供了一种高通量检测BMP的方法，所述方法包括：将BMP标准品和PG标准品分别衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述BMP标准品和所述PG标准品进行分离、检测，建立关于所述BMP的高通量液相色谱串联质谱数据库；将样品衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述样品进行分离、检测，获得所述样品的BMP特征性离子；将获得的所述BMP特征性离子在所述高通量液相色谱串联质谱数据库中进行搜索，获得所述样品中关于所述BMP的信息。在本申请的实施方案中，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱对所述BMP标准品、所述PG标准品和所述样品进行分离、检测。在本申请的实施方案中，所述衍生化试剂为三甲基硅烷化重氮甲烷。在本申请的实施方案中，所述衍生化如下进行：反应加入甲基叔丁基醚、甲醇和水以及三甲基硅烷化重氮甲烷的混合液，反应条件为20℃-80℃，反应30分钟-120分钟，酸终止反应后，离心旋干备用。在本申请的实施方案中，可选地，甲基叔丁基醚、甲醇、水、三甲基硅烷化重氮甲烷按200∶60∶50∶30的体积比添加。在本申请的实施方案中，在衍生化反应中，可以用甲酸或乙酸终止反应。在本申请的实施方案中，建立关于所述BMP的高通量液相色谱串联质谱数据库包括：BMP标准品和PG标准品的制备，BMP标准品和PG标准品的衍生化，BMP标准品和PG标准品的前处理，BMP标准品和PG标准品的液相色谱分离，BMP标准品和PG标准品的串联质谱检测，特征性离子碎片信息提取，以及高通量液相色谱串联质谱数据库建立。具体地，建立关于所述BMP的高通量液相色谱串联质谱数据库包括：(1)标准品的制备：将BMP和PG的标准品分别用二氯甲烷∶甲醇＝2∶1溶解然后稀释到5μg/mL，吹干后备用；(2)衍生化反应：将MP和PG的标准品溶液分别进行衍生化反应，衍生化试剂为三甲基硅烷化重氮甲烷，衍生化条件为：加入甲基叔丁基醚、甲醇和水以及三甲基硅烷化重氮甲烷的混合液，20℃-80℃，反应30分钟-120分钟，用甲酸或乙酸终止反，离心旋干备用，可选地，甲基叔丁基醚、甲醇、水、三甲基硅烷化重氮甲烷按200∶60∶50∶30的体积比添加；(3)样品前处理：将衍生化后的标准品用氯仿甲醇2∶1(v∶v)的复溶试剂溶解，离心取上清转移到上样瓶中；(4)液相色谱分离：利用与质谱串联的超高效液相色谱(UltraHighPerformanceLiquidChromatography，UHPLC)及相应的流动相，在反向色谱柱C18分析柱上对衍生化标准品进行检测，液相色谱条件包括：色谱柱：Waters，色谱柱温：30℃；进样量lμl-5μl；流速：0.2ml/min；流动相组成：A相为10mM醋酸铵溶液和60％(v∶v)乙腈水溶液，B相为异丙醇，洗脱梯度如表1。表1液相色谱分离的洗脱梯度时间流速(mL/min)A％B％100.2595230.25953200.29554240.29555250.25956300.2595(5)串联质谱检测：将色谱分离后的标准品进入到质谱仪进行检测，利用高分辨质谱仪中的数据依懒性采集模式检测，质谱检测条件如下：一级全扫描模式分辨率：70000，二级碎片分辨率：17000。源参数如下：喷淋电压：3000伏；毛细管温度：320℃；加热器温度：300℃；鞘气流速：35arb；辅助气体流量：10arb。(6)通过定性分析软件Xcalibur提取标准品采集所获得的PG和BMP的特征性碎片信息，选择出不同于PG离子的BMP特异的定性离子作为BMP鉴定的特征性碎片，将获得的母离子、特征碎片的信息输入到高分辨质谱仪工作站，依此建立BMP特征性碎片数据库用来进行高通量BMP分析。在本申请的实施方案中，所述特征性离子碎片信息提取包括通过定性分析软件提取所述BMP和所述PG标准品衍生化物的母离子、碎片离子及保留时间信息，其中将BMP正离子模式中母离子对应的子离子的单酰基甘油磷酸酯中性丢失选为特征子离子，负离子模式中脂肪酸链碎片和单酰基甘油中性丢失选为特征离子。在本申请的实施方案中，在所述正离子模式中，所述BMP的母离子为脂肪酸链14∶0至24∶4的所有分子，碎片离子包括单酰基甘油磷酸酯中性丢失，特征子离子为该中性丢失；在所述负离子模式中，所述BMP的母离子为脂肪酸链14∶0至24∶4的所有分子，碎片离子包括脂肪酸链碎片和单酰基甘油中性丢失，特征子离子为脂肪酸链碎片和中性丢失。在本申请中，提到“脂肪酸链14∶0至24∶4”中的比值指的是，碳原子数与双键数的比值，例如脂肪酸链14∶0至24∶4指的是碳原子数14至24中的双键数从0至4的所有脂肪酸。在本申请的实施方案中，在所述高通量检测BMP的方法中，使用液相色谱串联质谱对样品进行分离、检测包括：(1)样品制备：称取新鲜的组织样品100mg，加入1mL氯仿∶甲醇＝2∶1溶液，匀浆5分钟，加入500μl超纯水，涡旋，静置10分钟，重复3次，3000rpm离心20分钟，取有机相转移到新的样品管中，氮气吹干备用；(2)衍生化：将上述获得的样品进行衍生化反应，以提高样品在质谱上的信号响应，同时可以更好的与同分异构体分开，衍生化试剂为三甲基硅烷化重氮甲烷，衍生化条件为：加入甲基叔丁基醚、甲醇和水以及三甲基硅烷化重氮甲烷的混合液，20℃-80℃，反应30分钟-120分钟，用甲酸或乙酸终止反，离心旋干备用，可选地，甲基叔丁基醚、甲醇、水、三甲基硅烷化重氮甲烷按200∶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量检测双磷脂的方法，所述方法包括：将双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品分别衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述双磷脂和所述磷脂酰甘油标准品进行分离、检测，建立关于所述双磷脂的高通量液相色谱串联质谱数据库；将样品衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述样品进行分离、检测，获得所述样品的双磷脂特征性离子；将获得的所述双磷脂特征性离子在所述高通量液相色谱串联质谱数据库中进行搜索，获得所述样品中关于所述双磷脂的信息。

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测双磷脂的方法，所述方法包括：将双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品分别衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述双磷脂和所述磷脂酰甘油标准品进行分离、检测，建立关于所述双磷脂的高通量液相色谱串联质谱数据库；将样品衍生化，使用液相色谱串联质谱对所述样品进行分离、检测，获得所述样品的双磷脂特征性离子；将获得的所述双磷脂特征性离子在所述高通量液相色谱串联质谱数据库中进行搜索，获得所述样品中关于所述双磷脂的信息。2.根据权利要求1所述的高通量检测双磷脂的方法，其中，使用超高效液相色谱串联高分辨质谱对所述双磷脂标准品和所述磷脂酰甘油标准品以及所述样品进行分离、检测。3.根据权利要求1所述的高通量检测双磷脂的方法，其中，所述衍生化试剂为三甲基硅烷化重氮甲烷。4.根据权利要求1所述的高通量检测双磷脂的方法，其中，所述衍生化如下进行：加入甲基叔丁基醚、甲醇和水以及三甲基硅烷化重氮甲烷的试剂混合液，反应条件为20℃-80℃，反应时间为30分钟-120分钟，用甲酸或乙酸终止反应后，离心旋干备用。5.根据权利要求1所述的高通量检测双磷脂的方法，其中，建立关于所述双磷脂的高通量液相色谱串联质谱数据库包括：双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的制备，双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的衍生化，双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的前处理，双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的液相色谱分离，双磷脂标准品和磷脂酰甘油标准品的串联质谱检测，特征性离子碎片信息提取，以及高通量液相色谱串联质谱数据库建立。6.根据权利要求5所述的高通量检测双磷脂的方法，其中，所述特征性离子碎片信息提取包括通过定性分析软件提取所述双磷脂标准品和所述磷脂酰甘油标准品衍生化物的母离子、碎片离子及保留时间信息，其中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓蕙，许丽娜，王雪颖，焦玉佩，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11