本发明专利技术公开了一种超高效液相色谱‑串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，采用以下步骤：前处理；标准溶液的配制；获得液相色谱质谱图、回归方程；超高效液相色谱‑串联质谱法对样品进行分析检测。本研究采用超高效液相色谱‑电喷雾串联质谱法完成豆芽中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星10种喹诺酮物质的分析测定。对样品提取条件、净化手段、液相色谱‑质谱参数等条件进行了优化，对方法的基质效应进行了评价。结果表明，方法的建立，解决了豆芽中多种喹诺酮类抗生素同时测定的难题，为风险评估和政府监管提供技术参考。
【技术实现步骤摘要】
超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法
本专利技术属于涉及一种超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，属于食品检测
技术介绍
豆芽是我国一种传统的蔬菜，富含蛋白质、B族维生素和微量元素。因其营养丰富、易于烹调，深受老百姓的喜爱。自2010年以来，关于“毒豆芽”的报道层出不穷，一些不良商贩将恩诺沙星等喹诺酮类药物添加到豆芽的生产过程中，以达到抑菌杀菌的目的。长期食用这种豆芽，会对人体造成一定的危害，产生耐药性或一些毒副作用。我国国家农业部公告第235号，明确规定了动物性食品中喹诺酮类抗生素(以环丙沙星和恩诺沙星之和计)最高残留限量不得超过100μg/kg，但对蔬菜中喹诺酮的使用并无特殊规定。据文献报道，豆芽中恩诺沙星的检出率高达37％。因此有必要建立一套豆芽中恩诺沙星等喹诺酮类抗生素的检测方法。近年来，对喹诺酮类抗生素残留的分析研究，大多局限在动物性食品领域，而对蔬菜，尤其是豆芽基质中的残留分析研究较少，且研究对象仅限于恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星等一种或少数几种化合物，方法具有一定局限性。目前报道的食品中喹诺酮类物质的检测方法多为液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法。由于高效液相色谱-串联质谱法具有选择性强、灵敏度高及检测通量大等优点，在非法添加及痕量物质残留检测方面，优势明显。
技术实现思路
本研究采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法完成豆芽中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星10种喹诺酮物质的分析测定。对样品提取条件、净化手段、液相色谱-质谱参数等条件进行了优化，对方法的基质效应进行了评价。结果表明，方法的建立，解决了豆芽中多种喹诺酮类抗生素的同时测定的难题，为风险评估和政府监管提供技术参考。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，采用以下步骤：(1)前处理：取均质样品，加入乙腈-0.1％甲酸水溶液，涡旋混匀，超声提取，离心，取上清液，注入PRIMEHLB固相萃取柱中，溶液通过固相萃取柱，收集样品净化液，45℃氮吹浓缩近干，初始流动相复溶，滤膜过滤，供UPLC-MS/MS检测；(2)标准溶液的配制：分别准确称取10种标准喹诺酮标准物质于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制质量浓度为1.00mg/mL的标准储备液，于-20℃避光保存；分别移取各标准物质储备液1.00mL于25mL容量瓶，用甲醇稀释，配制浓度为40μg/mL的混合标准中间液。移取适量混合标准中间液，用流动相逐级稀释，配制浓度为100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL的混合标准工作液，现用现配；10种标准喹诺酮标准物质为恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星；(3)获得液相色谱质谱图、回归方程：取不含喹诺酮类抗生素的空白样品，分别加入10种喹诺酮混合标准工作液，按与样品相同的处理方法，制备不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图；以基质标准溶液中各分析物的色谱峰面积为纵坐标，各分析物质的浓度值为横坐标作图，形成基质加标曲线，得到线性回归方程；(4)样品分析：超高效液相色谱-串联质谱法对样品进行分析检测。上述方法中，前处理的步骤为：(1)提取：取样品适量，均质，于-20℃保存，准确称取均质后的试样2.0g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈-0.1％甲酸水(8+2，v+v)溶液，涡旋混匀30s后，超声提取15min，于8000r/min离心5min，取上清液5mL，待净化；(2)净化：将上述上清液，注入PRIMEHLB固相萃取柱中，调节流速1滴/秒，使样品溶液慢慢通过固相萃取柱，收集样品净化液于15mL离心管中，45℃氮吹浓缩近干，用1mL乙腈-0.1％甲酸水(10+90，v+v)复溶，经0.22μm滤膜过滤，供UPLC-MS/MS检测。上述方法中，所述超高效液相色谱的条件为：色谱柱：AcquityUPLCBEHC18，柱长75mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm；所述超高效液相色谱的流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。流速0.30mL/min，梯度洗脱程序：0～3min，10％B～20％B；3.0～5.0min，20％～35％B；5.0～6.0min，35％～50％B；6.0～6.1min，50％～95％B；保持2min；8.0～8.1min，95％～10％B；8.1～10min，10％B；超高效液相色谱的柱温：35℃，进样体积：3μL。质谱条件为：电喷雾离子源，正离子模式；扫描模式：多反应监测；喷雾电压：5.0Kv；脱溶剂气温度：500℃；气帘气压力：35psi；雾化气压力：50psi；辅助雾化气：40psi；碰撞气压力：8psi。国内公开的技术中仅仅能检测最多四种喹诺酮类的抗生素，而且喹诺酮类的抗生素性质相似，基质效应较强，很难实现精准定性定量。本方法建立了同时检测豆芽中10种喹诺酮抗生素残留的方法，通过优化提取溶剂，有效提高了提取效率；采用PRIMEHLB固相萃取柱净化，减少了杂质的干扰；采用基质匹配标准溶液定量很好地消除了基质影响，提高了检测灵敏度。最终实现了快速、精准定性定量检测。为更有效地监控市场违法添加喹诺酮类抗生素的行为，提供了技术支持，保障了人民食品安全。有益效果本专利技术较现有技术，大大的缩短了分析时间，提高了检测效率；准确度高且稳定；本专利技术中除环丙沙星检出限为2μg/kg，其它9中喹诺酮类抗生素的检出限均为1μg/kg，检出限远低于现有文献报道水平，线性范围宽，提高了分析灵敏度，建立的豆芽中10种喹诺酮类抗生素中液质联用的分析方法，填补了国内豆芽中检测10种喹诺酮类抗生素质谱定性定量法的空白，对国内的探索研究具有重要意义。附图说明图14种提取剂对10种喹诺酮类抗生素回收率的影响；图2豆芽基质中10种喹诺酮类抗生素的MRM谱图(20μg/kg)。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例11实验部分1.1仪器、试剂及材料ABSciex5500串联质谱仪(美国ABSciex公司)；AQUITYUPLCI-Class超高效液相色谱仪(美国waters公司)；MilliQ去离子水发生器(美国Millipore公司)、N-EVAP48氮吹仪(美国Orangaomation公司)、IKAMS3涡旋混合器；0.22μm有机相针式滤器(中国ANPEL公司)。乙腈(美国Merck公司)；甲酸(美国FisherScientific公司)；PRIMEHLB净化柱(100mg,6mL,美国waters公司)；恩诺沙星(CASNO.93106-60-6)、环丙沙星(CASNO.85721-33-1)、诺氟沙星(CASNO.70458-96-7)、培氟沙星(CASNO.70458-92-3)、氧氟沙星(CASNO.82419-36-1)、沙拉沙星(CASNO.98105-99-8)、达氟沙星(CASNO.11239本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种超高效液相色谱‑串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）前处理：取样品均质，加入乙腈‑0.1%甲酸水溶液，涡旋混匀，超声提取，离心，取上清液，注入PRIME HLB固相萃取柱中，溶液通过固相萃取柱，收集样品净化液，45℃氮吹浓缩近干，初始流动相复溶，滤膜过滤，供UPLC‑MS/MS检测；（2）标准溶液的配制：分别准确称取10种标准喹诺酮标准物质于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制质量浓度为1.00mg/mL的标准储备液，于‑20℃避光保存；分别移取各标准物质储备液1.00mL于25mL容量瓶，用甲醇稀释，配制浓度为40μg/ mL的混合标准中间液；移取适量混合标准中间液，用流动相逐级稀释，配制浓度为100 ng/mL、200 ng/mL 、1000 ng/mL的混合标准工作液，现用现配；10种标准喹诺酮标准物质为恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星；（3）获得液相色谱质谱图、回归方程：取不含喹诺酮类抗生素的空白样品，分别加入10种喹诺酮混合标准工作液，按与样品相同的处理方法，制备不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图；以基质标准溶液中各分析物质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，各标准物质的浓度值为横坐标作图，形成基质加标曲线，得到线性回归方程；（4）样品分析：超高效液相色谱‑串联质谱法对样品进行分析检测。...
【技术特征摘要】
1.一种超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）前处理：取样品均质，加入乙腈-0.1%甲酸水溶液，涡旋混匀，超声提取，离心，取上清液，注入PRIMEHLB固相萃取柱中，溶液通过固相萃取柱，收集样品净化液，45℃氮吹浓缩近干，初始流动相复溶，滤膜过滤，供UPLC-MS/MS检测；（2）标准溶液的配制：分别准确称取10种标准喹诺酮标准物质于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制质量浓度为1.00mg/mL的标准储备液，于-20℃避光保存；分别移取各标准物质储备液1.00mL于25mL容量瓶，用甲醇稀释，配制浓度为40μg/mL的混合标准中间液；移取适量混合标准中间液，用流动相逐级稀释，配制浓度为100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL的混合标准工作液，现用现配；10种标准喹诺酮标准物质为恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星；（3）获得液相色谱质谱图、回归方程：取不含喹诺酮类抗生素的空白样品，分别加入10种喹诺酮混合标准工作液，按与样品相同的处理方法，制备不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图；以基质标准溶液中各分析物质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，各标准物质的浓度值为横坐标作图，形成基质加标曲线，得到线性回归方程；（4）样品分析：超高效液相色谱-串联质谱法对样品进行分析检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，前处理的步骤为：（1）提取：取样品适量，均质，于-20℃保存，准确...
【专利技术属性】
技术研发人员：宿书芳，程志，郑红，刘艳明，魏莉莉，丁一，薛霞，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37
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