一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法技术

一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，包括以下步骤：将外源基因导入到农杆菌中，并制成转化菌液；将受体材料浸泡到转化菌液中，再将受体材料置于共培养培养基中，培养得到侵染受体材料；将侵染受体材料置于RITA的选择培养基中，同时进行抗性筛选和再生；待苗高为0.5‑1cm时，将苗转移至改良MS培养基中进行生根诱导，得到生根的植株；将生根的植株移栽，得到转基因植株。本发明专利技术采用侵染受体广，植物叶片，愈伤组织，胚性细胞等均可为材料，通过农杆菌介导将外源基因导入植物细胞，直接通过浸没培养获得转基因植株，适合大规模的转基因批量生产。

An Agrobacterium-mediated and Immersed Culture Method for Genetically Modified Plants

A method for obtaining transgenic plants by Agrobacterium-mediated combined submerged culture includes the following steps: introducing exogenous genes into Agrobacterium tumefaciens and producing transforming bacterial solution; immersing the receptor material into transforming bacterial solution, and then placing the receptor material in co-culture medium to obtain the infecting receptor material; placing the infecting receptor material in RITA selective medium and carrying out the same process. Resistance screening and regeneration; when the seedling height is 0.5 1 cm, the seedlings are transferred to the improved MS medium for rooting induction, and the rooting plants are obtained; the rooting plants are transplanted and the transgenic plants are obtained. The invention adopts a wide range of infective receptors, plant leaves, callus, embryonic cells, etc. as materials, transfers exogenous genes into plant cells through Agrobacterium mediation, obtains transgenic plants directly through immersion culture, and is suitable for large-scale mass production of genetically modified plants.

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法
本专利技术属于植物组织培养领域，涉及一种高通量快速获得转基因植物的方法，特别涉及一种农杆菌介导结合浸没式培养快速获得转基因植物的方法。
技术介绍
快速简便的转化方法是植物转基因研究领域的重要内容，是开展大规模基因功能研究和开发转基因植物新品种的有效技术手段。一直以来，植物转基因技术不断改进，转基因技术也日趋完善。随着转基因植物的种植面积和效益逐年增加，对转基因作物品种的需求也日益增大，导致对转基因技术的效率也越来越高，高效快速的转基因技术体系是缓解当前对转化要求的有效手段。转基因技术可以现有品种品种进行定向改良，特别是在提高甘蔗的抗虫，抗除草剂能力上有着广泛对应用前景。但是，甘蔗转基因技术和其它植物相比，相对落后，直到上世纪九十年代才有成功的报道，但是大量获得甘蔗转基因的研究较少。采用浸没式培养的方法通过农杆菌介导转化可以实现大规模高通量的转化，获得大量转化植株，满足研究和生产的需求。解决当前传统的转化方法费时费力，同时受到再生体系建立困难的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种通过浸没式培养快速获得转基因植物的方法。该方法是直接以胚性细胞或植物叶片为转基因受体，通过农杆菌介导，在培养瓶中完成抗性筛选和再生过程，快速获得转基因甘蔗的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，包括以下步骤：(1)将外源基因导入到农杆菌中，得到含有外源基因的农杆菌；将含有外源基因的农杆菌培养至对数生长期，收集菌体，将菌体重悬于含100～120μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，得到转化菌液；(2)侵染将受体材料置于(1)制备的转化菌液中浸泡培养后，将受体材料表面的液体吸干；再将受体材料置于共培养培养基中，于25±2℃暗培养3-4天，得到侵染受体材料；所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L2,4-D、2～2.5mg/L6-BA、100～120μmol/LAS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至5.5～6.0；或者，所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L6-BA、100～120μmol/LAS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至pH5.5；(3)通过间歇浸没培养进行分化与抗性筛选将侵染受体材料置于气泵驱动RITA间歇浸没式生物反应器的培养容器中，在所述RITA反应器的营养液储存容器加入选择培养基，同时进行抗性筛选和再生，所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加1～1.5mg/L2,4-D、3～3.5mg/L6-BA、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；或者，所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加3～3.5mg/L6-BA、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；(4)待苗高为0.5-1cm时，将苗转移至改良MS培养基中进行生根诱导，得到生根的植株；改良MS培养基是在MS培养基的基础上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L3-吲哚丁酸、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8`6.0；或者，改良MS培养基是在MS培养基的基础上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L3-吲哚丁酸、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；(5)将生根的植株移栽，得到转基因植株。优选地，步骤(1)中所述的外源基因为：膦丝菌素乙酰转移酶基因Bar。优选地，步骤(1)中所述的将含有外源基因的农杆菌培养得到转化菌液的方法为：将含有外源基因的农杆菌接种于YEB液体培养基中，于28℃摇床过夜，得到第一菌液；再按体积百分比1％接种量将第一菌液转接入新的一份YEB液体培养基中培养至OD600为0.4～0.6，得到第二菌液；将第二菌液在4℃、6000～7000rpm的条件下离心收集菌体；将菌体转移至含100μmol/LAS的MS液体培养基中重新悬浮沉淀，培养至OD600为0.4～0.6，得到第三菌液；将第三菌液转入含100μmol/LAS的MS液体培养基中，28℃摇床上培养至OD600到0.4～0.7。优选地，所述YEB液体培养基中含有抗生素。优选地，步骤(2)中所述浸泡培养的时间为20～35min。优选地，步骤(2)中所述的受体材料为厚度为0.3-0.5cm的无菌植物叶片愈伤组织或胚性细胞。优选地，步骤(2)中所述的植物叶片为甘蔗或烟草。优选地，步骤(3)中所述的间歇浸没培养，每次浸没时间为1.5～2min，采用两次浸没之间的时间间隔为2～3h/次。优选地，步骤(3)中所述选择培养基15～25天更换一次。优选地，步骤(5)中所述的移栽的基质优选为园土和泥炭土按质量比1：1混合得到。AS为乙酰丁香酮；2,4-D为二氯苯氧乙酸，2,4-DichlorophenoxyaceticAcid，2,4二氯苯氧乙酸；6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，别名：6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素，英文通用名：6-Benzylaminopurine，分子式：C12H11N5。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术采用侵染受体广，植物叶片，愈伤组织，胚性细胞等均可为材料，通过农杆菌介导将外源基因导入植物细胞，直接通过浸没培养获得转基因植株，适合大规模的转基因批量生产。本方法可以缩短研制时间，整个过程只需要2-3个月。同时，转化获得的苗壮，移植后成活率高。该方法简单，易行。以抗草丁膦的Bar对植物愈伤组织和叶片进行转化，获得了含有Bar的抗除草剂转基因烟草和甘蔗，证实了该方法的可行性。(2)本方法和目前采用的转基因方法相比较，不受材料限制，每次转化的材料多，操作简便，不需要反复的继代工作，省时省力，更适合大规模的转基因植物研制。本方法采用液体培养，抗生素溶液更容易渗入到植物体内部，更容易控制农杆菌的二次污染，成功率高。该方法培养时间短，避免了长期组织培养过程中，外源激素导致变异的影响。本方法采用浸没式培养，为获得转基因植物提供新方法。(3)本专利技术转化效率高，而且具有可拓展性，可以适用于大规模转基因甘蔗的研制，大大减少工作量，降低研究费用。附图说明图1为转化后获得的转化甘蔗植株；图2为转化后获得的转化烟草植株生根诱导；图3为转化后获得的转化烟草植株；图4为转基因甘蔗PCR检测结果；图5为转基因烟草PCR检测结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因甘蔗植株的方法，包括以下步骤：(1)制备含有Bar基因的农杆菌LBA4404农杆菌LBA4404感受态细胞购买于宝生物工程(大连)有限公司，Bar基因来源于商业载体Pcambia3301；将Pcambia3301质粒载体按照《分子克隆》的方法，导入到农杆菌LBA4404感受态细胞中，得到含有Bar基因的农杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将外源基因导入到农杆菌中，得到含有外源基因的农杆菌；将含有外源基因的农杆菌培养至对数生长期，收集菌体，将菌体重悬于含100～120μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，得到转化菌液；(2)侵染将受体材料置于(1)制备的转化菌液中浸泡培养后，将受体材料表面的液体吸干；再将受体材料置于共培养培养基中，于25±2℃暗培养3‑4天，得到侵染受体材料；所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L 2,4‑D、2～2.5mg/L 6‑BA、100～120μmol/L AS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至5.5～6.0；或者，所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L 6‑BA、100～120μmol/L AS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至pH 5.5～6.0；(3)通过间歇浸没培养进行分化与抗性筛选将侵染受体材料置于气泵驱动RITA间歇浸没式生物反应器的培养容器中，在所述RITA反应器的营养液储存容器加入选择培养基，同时进行抗性筛选和再生，所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加1～1.5mg/L 2,4‑D、3～3.5mg/L 6‑BA、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；或者，所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加3～3.5mg/L6‑BA、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；(4)待苗高为0.5‑1cm时，将苗转移至改良MS培养基中进行生根诱导，得到生根的植株；改良MS培养基是在MS培养基的基础上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L 3‑吲哚丁酸、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；或者，改良MS培养基是在MS培养基的基础上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L 3‑吲哚丁酸、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；(5)将生根的植株移栽，得到转基因植株。...

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将外源基因导入到农杆菌中，得到含有外源基因的农杆菌；将含有外源基因的农杆菌培养至对数生长期，收集菌体，将菌体重悬于含100～120μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，得到转化菌液；(2)侵染将受体材料置于(1)制备的转化菌液中浸泡培养后，将受体材料表面的液体吸干；再将受体材料置于共培养培养基中，于25±2℃暗培养3-4天，得到侵染受体材料；所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L2,4-D、2～2.5mg/L6-BA、100～120μmol/LAS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至5.5～6.0；或者，所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L6-BA、100～120μmol/LAS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至pH5.5～6.0；(3)通过间歇浸没培养进行分化与抗性筛选将侵染受体材料置于气泵驱动RITA间歇浸没式生物反应器的培养容器中，在所述RITA反应器的营养液储存容器加入选择培养基，同时进行抗性筛选和再生，所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加1～1.5mg/L2,4-D、3～3.5mg/L6-BA、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；或者，所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加3～3.5mg/L6-BA、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；(4)待苗高为0.5-1cm时，将苗转移至改良MS培养基中进行生根诱导，得到生根的植株；改良MS培养基是在MS培养基的基础上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L3-吲哚丁酸、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；或者，改良MS培养基是在MS培养基的基础上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L3-吲哚丁酸、500～600mg/LAmp以及包括抗生素...

【专利技术属性】
技术研发人员：张木清，王继华，徐世强，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45