一套用于水稻的人工基因编辑系统技术方案

本申请涉及一套用于水稻的基因编辑的人工基因编辑系统，其包括：第I调节元件，其包括能够编码如氨基酸序列I的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列I包括如I‑1氨基酸序列、I‑2氨基酸序列和I‑3氨基酸序列中的一种；第II调节元件，其包括依次从5’端到3’端串联的第II‑1核苷酸序列和第II‑2核苷酸序列；所述第II‑1核苷酸序列包括靶核苷酸序列；所述靶核苷酸序列来源于目标生物的基因组中，并且所述靶核苷酸序列中含有目标生物基因组中待突变的靶位点；所述第II‑2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌的sgRNA核酸序列；所述第II‑1核苷酸序列和所述第II‑2核苷酸序列转录融合。

An Artificial Gene Editing System for Rice

This application relates to a set of artificial gene editing system for rice gene editing, which includes: I regulatory element, which includes nucleotide sequence capable of coding amino acid sequence I, which includes one of amino acid sequence I, I 2 amino acid sequence and I 3 amino acid sequence, and II regulatory element, which includes series connection from 5'end to 3' end in turn. The second 1 nucleotide sequence and the second 2 nucleotide sequence; the second 1 nucleotide sequence includes the target nucleotide sequence; the target nucleotide sequence originates from the genome of the target organism, and the target nucleotide sequence contains the target site for mutation in the genome of the target organism; the second 2 nucleotide sequence includes the sgRNA nucleotide sequence originating from Streptococcus pyogenes; The transcriptional fusion of the II 1 nucleotide sequence and the II 2 nucleotide sequence is described.

【技术实现步骤摘要】
一套用于水稻的人工基因编辑系统
本申请涉及一套用于水稻的人工基因编辑系统。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)是世界主要粮食作物之一，养活了世界上近一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口。中国是世界上水稻总产量最高的国家，水稻产量占全球总量的30％左右。在生产过程中，以稻瘟病、稻曲病和纹枯病为主的水稻三大病害严重制约着水稻的生长发育，导致水稻产量和品质降低，威胁着全球的粮食安全。因此，提高产量，改善稻米品质，增加水稻植株抗病、抗逆性等研究以保证粮食的稳定供给是人类社会可持续性发展的重大课题。水稻作为单子叶植物的模式植物，其研究技术、方法、理论和成果对其它禾本科植物，如小麦、玉米、高粱等具有重要指导作用。近年来发展起来的CRISPR/Cas9系统因为可以对基因组进行定点修饰而极具应用性。不过CRISPR/Cas9系统在进行核酸切割时，需要识别引导RNA(gRNA)3’端保守的PAM序列。现在最常用的SpCas9所识别PAM序列主要是NGG，尽管SpCas9也可识别NAG，以及SpCas9(VQR)可识别NGA等，但其编辑效率均较低；同时基于CRISPR/SpCas9系统发展而来的碱基编辑技术也会因所编辑靶位点的特殊性及可能没有合适的PAM序列导致碱基编辑效率受到限制，这些都在很大程度上限制了CRISPR/Cas9系统在水稻基因组编辑中应用。因此，如果能开发出一种可更高效、适用范围更广、通用性更强、DNA特异性更强的对植物基因组，特别是水稻基因组进行定点编辑的CRISPR/Cas9系统，不仅会大大提高对植物基因组编辑的效率，而且将被更广泛的应用于植物基因功能研究、作物育种等方面，将会极大地促进植物基因组编辑领域的进程。
技术实现思路
本申请提供了一套人工基因编辑系统，所述人工基因编辑系统包括：第I调节元件，其包括能够编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；其中所述氨基酸序列I包括如I-1氨基酸序列、I-2氨基酸序列和I-3氨基酸序列中的一种，其中所述I-1氨基酸序列为如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；所述I-2氨基酸序列包括依次从N端到C端串联的SEQIDNo.2、SEQIDNo.1和SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；所述I-3氨基酸序列包括依次从N端到C端串联的SEQIDNo.4和SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；第II调节元件，其包括依次从5’端到3’端串联的第II-1核苷酸序列和第II-2核苷酸序列；所述第II-1核苷酸序列包括靶核苷酸序列；所述靶核苷酸序列来源于目标生物的基因组中，并且所述靶核苷酸序列中含有目标生物基因组中待突变的靶位点；所述第II-2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的sgRNA核酸序列；所述第II-1核苷酸序列和所述第II-2核苷酸序列转录融合，其产物能引导第I调控元件编码的蛋白至目标生物基因组中待突变的靶位点处，并将靶位点处产生碱基进行突变；当所述第II调节元件为多个时，包含在每一个所述第II调节元件中的第II-1核苷酸序列两两不相同。另外，当所述第II调节元件为多个时，这些第II调节元件可以串联的形成连接在一起。本申请中，人工基因编辑系统中的靶核苷酸序列由该人工基因编辑系统本身与目标生物基因组中的待突变的靶位点共同确定，并且，如上所述，靶核苷酸序列来源于目标生物的基因组中，因此，靶核苷酸序列上的所述靶位点与目标生物基因组中的待突变的靶位点序列一致，因此，为了表述简便起见，两者均称之为靶位点，但突变发生在目标生物的基因组的序列上，而非发生在人工基因编辑系统的序列上。在一个具体实施方式中，当使用所述I-1氨基酸序列时，所述靶核苷酸序列中的靶位点处于所述靶核苷酸序列的从3′端到5′端方向的3至5位置中的任意一处；当使用所述I-2氨基酸序列时，所述靶核苷酸序列中的靶位点为处于所述靶核苷酸序列的从5′端到3′端方向的2至10位置中的碱基C；当使用所述I-3氨基酸序列时，所述靶核苷酸序列中的靶位点为处于所述靶核苷酸序列的从5′端到3′端方向的2至8位置中的碱基A。当所述氨基酸序列I为如I-1氨基酸序列时，通过利用本申请的人工基因编辑系统，可以将水稻基因组中内源的特定位点处缺失或在其中插入一个或数个碱基，筛选得到水稻基因相应的缺失或插入突变体。对于这些缺失或插入突变体，有可能会使原基因的功能丢失，也有可能使原基因的功能发生减弱或增强，这取决于实际发生的情况，根据实际需要，选择保留或舍弃那些已完成基因序列检测的突变体。或者，当所述氨基酸序列I为如I-2氨基酸序列时，当第I调节元件通过利用本申请的人工基因编辑系统，可以将水稻基因组中内源的特定碱基C定点突变为T、A或G中的一种，筛选得到水稻基因功能“矫正”突变体。或者对于其反向互补序列来讲，将G定点突变为A、T或C中的一种，筛选得到水稻基因功能“矫正”突变体，此时，使用的靶核苷酸序列为靶位点处为C那条链上的核苷酸序列。或者，当所述氨基酸序列I为如I-3氨基酸序列时，通过利用本申请的人工基因编辑系统，可以将水稻基因组中内源的特定碱基A定点突变为G，筛选得到水稻基因功能“矫正”突变体。或对于其反向互补序列来讲，将T定点突变为C，筛选得到水稻基因功能“矫正”突变体，此时，使用的靶核苷酸序列为靶位点处为A那条链上的核苷酸序列。在一个具体实施方式中，所述目标生物为水稻，所述第I调节元件的核苷酸序列为能够适于在水稻中表达的核苷酸序列，所述第II调节元件的核苷酸序列为能够适于在水稻中发生转录的核苷酸序列。在一个具体实施方式中，能够编码如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQIDNo.5所示。如SEQIDNo.5所示核苷酸编码序列能够较优的在水稻中使用。在一个具体实施方式中，能够编码如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQIDNo.6所示。如SEQIDNo.6所示核苷酸编码序列能够较优的在水稻中使用。在一个具体实施方式中，能够编码如SEQIDNo.3所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQIDNo.7所示。如SEQIDNo.7所示核苷酸编码序列能够较优的在水稻中使用。在一个具体实施方式中，能够编码如SEQIDNo.4所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQIDNo.8所示。如SEQIDNo.8所示核苷酸编码序列能够较优的在水稻中使用。在一个具体实施方式中，所述第II-2核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。在一个具体实施方式中，所述第II-1核苷酸序列还包括含有IIS型限制性内切酶的酶切位点的克隆位点，所述靶核苷酸序列通过所述第II-1核苷酸序列上的所述克隆位点而被克隆到其中(例如通过酶切-连接的方式将所述靶核苷酸序列连接到所述克隆位点上)，以使所述第II-1核苷酸序列与第II-2序列转录融合；当所述第II调节元件为多个时，用于克隆不同靶核苷酸序列的所述IIS型限制性内切酶的酶切位点两两不相同。其中，由于所述靶核苷酸序列是根据碱基编辑位点而变化的，因此可以将包括事先克隆到相关位置的限制性内切酶的酶切位点在内的其他元件构建好。在使用之前，再根据碱基编辑目的将所述靶核苷酸序列通过限制性内切酶的酶切位点的切割而被克隆。当所述第II调节元件为多个时，包含在其中的多个第II-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一套人工基因编辑系统，所述人工基因编辑系统包括：第I调节元件，其包括能够编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；其中所述氨基酸序列I包括如I‑1氨基酸序列、I‑2氨基酸序列和I‑3氨基酸序列中的一种，其中所述I‑1氨基酸序列为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述I‑2氨基酸序列包括依次从N端到C端串联的SEQ ID No.2、SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；所述I‑3氨基酸序列包括依次从N端到C端串联的SEQ ID No.4和SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；第II调节元件，其包括依次从5’端到3’端串联的第II‑1核苷酸序列和第II‑2核苷酸序列；所述第II‑1核苷酸序列包括靶核苷酸序列；所述靶核苷酸序列来源于目标生物的基因组中，并且所述靶核苷酸序列中含有目标生物基因组中待突变的靶位点；所述第II‑2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的sgRNA核酸序列；所述第II‑1核苷酸序列和所述第II‑2核苷酸序列转录融合，其产物能引导第I调控元件编码的蛋白至目标生物基因组中待突变的靶位点处，并将所述靶位点处的碱基进行突变；当所述第II调节元件为多个时，包含在每一个所述第II调节元件中的第II‑1核苷酸序列两两不相同。...

【技术特征摘要】
1.一套人工基因编辑系统，所述人工基因编辑系统包括：第I调节元件，其包括能够编码如氨基酸序列I的核苷酸序列；其中所述氨基酸序列I包括如I-1氨基酸序列、I-2氨基酸序列和I-3氨基酸序列中的一种，其中所述I-1氨基酸序列为如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；所述I-2氨基酸序列包括依次从N端到C端串联的SEQIDNo.2、SEQIDNo.1和SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；所述I-3氨基酸序列包括依次从N端到C端串联的SEQIDNo.4和SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；第II调节元件，其包括依次从5’端到3’端串联的第II-1核苷酸序列和第II-2核苷酸序列；所述第II-1核苷酸序列包括靶核苷酸序列；所述靶核苷酸序列来源于目标生物的基因组中，并且所述靶核苷酸序列中含有目标生物基因组中待突变的靶位点；所述第II-2核苷酸序列包括来源于化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的sgRNA核酸序列；所述第II-1核苷酸序列和所述第II-2核苷酸序列转录融合，其产物能引导第I调控元件编码的蛋白至目标生物基因组中待突变的靶位点处，并将所述靶位点处的碱基进行突变；当所述第II调节元件为多个时，包含在每一个所述第II调节元件中的第II-1核苷酸序列两两不相同。2.根据权利要求1所述的人工基因编辑系统，其特征在于，当使用所述I-1氨基酸序列时，所述靶核苷酸序列中的靶位点处于所述靶核苷酸序列的从3′端到5′端方向的3至5位置中的任意一处；当使用所述I-2氨基酸序列时，所述靶核苷酸序列中的靶位点为处于所述靶核苷酸序列的从5′端到3′端方向的2至10位置中的碱基C；当使用所述I-3氨基酸序列时，所述靶核苷酸序列中的靶位点为处于所述靶核苷酸序列的从5′端到3′端方向的2至8位置中的碱基A。3.根据权利要求1或2所述的人工基因编辑系统，其特征在于，所述目标生物为水稻，所述第I调节元件的核苷酸序列为能够适于在水稻中表达的核苷酸序列，所述第II调节元件的核苷酸序列为能够适于在水稻中发生转录的核苷酸序列；优选能够编码如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQIDNo.5所示；能够编码如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQIDNo.6所示；能够编码如SEQIDNo.3所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQIDNo.7所示；能够编码如SEQIDNo.4所示氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQIDNo.8所示；优选所述第II-2核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的人工基因编辑系统，其特征在于，所述第II-1核苷酸序列的3’端还包括含有IIS型限制性内切酶的酶切位点的克隆位点，所述靶核苷酸序列通过所述第II-1核苷酸序列上的所述克隆位点而被克隆到其中，以使所述第II-1核苷酸序列与第II-2序列转录融合；当所述第II调节元件为多个时，用于克隆不同靶核苷酸序列的所述IIS型限制性内切酶的酶切位点两两不相同。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的人工基因编辑系统，其特征在于，通过如下方式确定所述靶核苷酸序列：1)确定水稻基因组上需要被改造的核苷酸序列；2)判断步骤1)中所确定的需要被改造的核苷酸序列为基因组中的特异性序列，并根据所述第I调节元件来判断待突变的核苷酸位点的碱基发...

【专利技术属性】
技术研发人员：周焕斌，柳浪，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11