一种青霉及其生产烟曲霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种新的青霉(Penicillium sp.)HS‑NF‑684Z，保藏编号为：CGMCC No.14144；同时公开了通过培养它制备烟曲霉素或者含有烟曲霉素的药物组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种青霉及其生产烟曲霉素的方法
本专利技术涉及微生物工程
，具体涉及一种新的青霉及其在制备烟曲霉素中的应用。
技术介绍
烟曲霉素(式I)最初被用来杀死蜜蜂的微孢子虫寄生虫，后来发现可以用于治疗人肠道感染引起的微孢子虫病和(或)隐孢子虫病，而这种疾病对于免疫缺陷患者是相当致命的。近年来，随着对烟曲霉素及其类似物研究的深入，有报道表明烟曲霉素及其类似物具有抗血管生成的活性，可以通过与人甲硫氨酸氨肽酶-2(MetAP-2)结合，从而阻断血管的形成。因此，烟曲霉素及其类似物被广泛用于治疗癌症的血管生成抑制剂。现有技术中，F.R.Hanson等报道了烟曲霉素最初是从烟曲霉Aspergillusfumigatus的发酵培养物中分离得到的天然产物，并在随后的研究中公开了生产工艺(EbleandHanson,1951；McCowenetal.,1951)；J.C.Frisvad(Persoonia，vol.14，no.2，177-182，1990)等公开了首次从一种青霉菌Penicilliumscabrosum的发酵培养物中发现烟曲霉素，并对该菌株的形态进行了详细的描述；Z.Barboráková等(JournalofMicrobiology,BiotechnologyandFoodSciences，2012:1(4)466-477)公开了P.scabrosumFCB353经过培养优化，产烟曲霉素的效价可以达到110mg/L。由此可见，现有技术中所使用的烟曲霉素生产菌比较原始，发酵水平低，因此寻找一种新的高效的烟曲霉素生产菌很有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种新的烟曲霉素生产菌，该菌为青霉(Penicilliumsp.)HS-NF-684Z，其保藏编号为CGMCCNo.14144。本专利技术青霉HS-NF-684Z的微生物菌种于2017年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.14144，分类名为青霉(Penicilliumsp.)，并登记在册，证明存活。本专利技术的目的还在于提供了一种青霉HS-NF-684Z(CGMCCNO.14144)在制备烟曲霉素或者含有烟曲霉素的药物组合物的应用。本专利技术还提供了一种烟曲霉素的制备方法，该方法包括采用青霉HS-NF-684Z(CGMCCNo.14144)在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。在优选的实施方案中，上述可同化的碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、山梨醇、甘露醇之一或者上述物质的组合，优选淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖。在优选的实施方案中，上述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者上述物质的组合，优选黄豆饼粉、酵母膏、酵母抽提粉、酵母粉。在优选的实施方案中，上述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或上述物质的组合，优选碳酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸三钠。在优选的实施方案中，所述营养培养基含有蔗糖40-1000g/L、糊精20-1000g/L、甘油10-80g/L、酵母抽提粉1-15g/L、酵母粉5-20g/L、酵母膏5-20g/L、硫酸镁1-10g/L、硫酸二氢钾1-5g/L、碳酸钙0-50g/L。在优选的实施方案中，所述有氧发酵的温度为20-30℃，优选23-28℃；培养基pH为5.0-8.0，优选5.0-7.0；培养时间为24-226小时，优选72-168小时；通氧量为0.1-2.0vvm，优选0.5-2.0vvm。在优选的实施方案中，所述青霉HS-NF-684Z是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；其中，所述种子液是将青霉HS-NF-684Z(CGMCCNo.14144)在种子培养基里进行种子培养得到的；所述种子培养的条件为：种子培养的温度为20℃-30℃，优选23℃-28℃；培养基pH为5.0-8.0，优选5.0-7.0；培养时间为24-80小时，优选24-60小时。在优选的实施方案中，所述的种子培养基含有葡萄糖5-20g/L、淀粉5-20g/L、黄豆饼粉5-20g/L、酵母抽提粉1-10g/L、碳酸钙1-20g/L，硫酸镁1-10g/L，硫酸二氢钾1-10g/L。本专利技术烟曲霉素通过以下条件进行HPLC检测：色谱柱：AccchromC18(4.6×250mm，5μm)柱温：25℃；进样体积：5μL；流速：1mL/min；检测波长：350nm；分析时间：40min；流动相：流动相A：0.1％(体积百分比)乙酸水溶液；流动相B：0.1％(体积百分比)乙酸乙腈溶液；时间(min)流动相A(％)流动相B(％)00:00653520:00109030:00109034:01653536:006535本专利技术青霉(Penicilliumsp.)HS-NF-684Z(CGMCCNO.14144)的主要生物学特征是：孢子呈圆形，孢子面呈蓝绿色，菌落颜色为黄色，反面黄褐色，表面呈现放射状沟纹，绒状，直径20-22mm。本专利技术青霉(Penicilliumsp.)HS-NF-684Z(CGMCCNO.14144)为一株全新的烟曲霉素产生菌，且其生产烟曲霉素的能力比现有技术中其他菌种有了大幅度的提高，效价可高达1000mg/L，有利于实现工业化生产。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中所用真菌DNA提取试剂盒购自北京三博远志生物技术有限责任公司；PCR产物纯化回收所用的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非限定本专利技术的范围。实施例1：菌株来源青霉HS-NF-684Z(CGMCCNo.14144)是一株从中国四川省成都市青城山某山坡的土壤中分离得到的青霉。在青城山区域土壤进行交叉采样，随机取5个采样点，每个点取土壤样品10g，放入锥形瓶中，混合均匀后取样品10g，加入到一个装入90mL无菌水的锥形瓶中(瓶中有一个磁力搅拌器)，漩涡搅拌30分钟，使其充分混匀制成悬浊液，即为10-1菌悬液。用稀释涂布平板法将上述悬浊液与无菌水按照体积比1：9稀释成10-2，10-3，10-4，10-5浓度，取不同稀释倍数菌悬液0.1mL，涂布于察氏培养基(Czapek–DoxMedium)平板中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布，室温下静置30分钟后置于25℃恒温培养箱。待菌落长出后，观察记录菌落颜色、透明度、菌落表面、边缘形态。最终挑取1000株菌株接种于察氏培养基制成斜面，并进行发酵验证。用接种环挑取斜面培养的菌体一环，分别接种于含有30mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于25℃条件下震荡培养1天后，再吸取1mL移种于含有20mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青霉(Penicillium sp.)HS‑NF‑684Z，其保藏编号为CGMCC No.14144。

【技术特征摘要】
1.一种青霉(Penicilliumsp.)HS-NF-684Z，其保藏编号为CGMCCNo.14144。2.根据权利要求1所述的青霉HS-NF-684Z在制备烟曲霉素或者含有烟曲霉素的药物组合物的应用。3.一种烟曲霉素的制备方法，其特征在于：包括采用如权利要求1所述的青霉HS-NF-684Z在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、山梨醇、甘露醇之一或者上述物质的组合，优选淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者上述物质的组合，优选黄豆饼粉、酵母膏、酵母抽提粉、酵母粉。6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于：所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或上述物质的组合，优选碳酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸三钠。7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张延青，钱娉婷，熊兵，邓爱文，姜南，李建宋，张辉，应灵萍，王继栋，滕云，郑玲辉，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33