一种棘孢曲霉菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物保护技术领域，具体涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，与蔬菜土传病害生物防治有关。从蔬菜土传病害发生严重的地块采集根际土壤，分离得到棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)Aa19，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018648。以保藏编号为CCTCC NO：M 2014314的豇豆枯萎病菌JWS‑1为指示菌测试棘孢曲霉菌株的稳定性、孢子悬浮液活性及发酵滤液的活性，通过生物功能验证，证明本发明专利技术的分离株对蔬菜土传病害具有良好的防效。棘孢曲霉Aa 19对蔬菜安全，稳定性好，抑菌活性较高，可用于土传病害‑豇豆枯萎病的生物防治。

【技术实现步骤摘要】
一种棘孢曲霉菌株及其应用
本专利技术属于植物保护
，具体涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，本专利技术与蔬菜土传病害生物防治领域相关。
技术介绍
我国设施蔬菜产业发展迅速，2014年全国设施蔬菜面积超过380万hm2(5700万亩)，蔬菜生产方式得到进一步丰富，对于保障蔬菜周年供应和调整蔬菜品种结构意义重大。与露地栽培相比，设施栽培棚室湿度高、轮作倒茬困难，为病虫害的发生流行提供了有利条件。设施地土壤的次生盐渍化、酸化，土壤养分失衡，土传病害严重，造成蔬菜产量下降、品质恶劣，严重制约了设施蔬菜生产的可持续发展。对设施蔬菜基地调查结果表明，猝倒病、立枯病、枯萎病、根腐病、黄萎病、青枯病、根结线虫等土传病害呈加重趋势。目前，针对这些病害主要以化学防治为主，但化学农药的长期和过量使用会导致生态环境破坏、次要病害猖獗、蔬菜农药残留超标等问题，直接影响了设施蔬菜的产量和品质，生物防治是一种环境友好且能够有效防治植物病害的方法，已成为继农业防治、化学防治之后的又一重要防治方法，并且有修复土壤生物多样性的作用，极具开发潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，为了解决设施蔬菜土传病害化学防治中的环境安全问题，提供一种分离的棘孢曲霉菌株及其在土传病害防治中的应用。本专利技术的技术方案如下所述：申请人于2017年7月，在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖蔬菜基地土传病害发生严重的地块，从设施蔬菜作物根际土壤中分离筛选得到一种拮抗真菌，申请人将该菌株命名为棘孢曲霉Aa19，AspergillusaculeatusAa19，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2018648。棘孢曲霉Aa19的菌学特征：棘孢曲霉Aa19菌株在PDA培养基平板上生长迅速，28℃培养5d菌落直径达6cm，质地紧密，呈丝绒状，气生菌丝较多，中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状，背面中心呈黄色四周白色，菌落表面有黑色干粉，无渗出液，顶囊初生时呈球形或辐射状，后呈球形或椭圆形，直径50-65μm，孢梗茎无色或淡褐糙有刺突，直径约5μm，串生于小梗顶端，小梗单层，全部表面可育。上述分离的棘孢曲霉Aa19菌株可在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用。本专利技术还提供了棘孢曲霉Aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用的具体步骤，所述的步骤包括：A.以豇豆枯萎病菌JWS-1作为指示菌用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(FusariumoxysporumSchl.)JWS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014314；B、棘孢曲霉Aa19的拮抗活性稳定性的测定在PDA培养基平板上对保藏编号为CCTCCNO：M2018648的棘孢曲霉Aa19进行了连续10代的继代培养，以豇豆枯萎病菌JWS-1为指示菌，采用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性；C、棘孢曲霉菌株Aa19孢子悬浮液活性的测定取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种，加入5mL无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径，明确棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性；D、棘孢曲霉Aa19发酵滤液活性的测定用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉Aa19菌丝，接种于50mL的PD培养基，180rpm/min、28℃恒温振荡培养5d，用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径，明确棘孢曲霉Aa19发酵滤液活性；E、活体盆栽将种子用55℃温水浸泡30min，清水清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，在接种病原菌7d后做如下处理：用棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查(在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理)；每处理3次重复，每重复10株，按时统计幼苗发病情况，按病情分级(参照张衍荣等，2005年报道)，计算病情指数和防治效果，计算公式如下；PDA培养基及制备方法：去皮马铃薯200g，切成厚约2mm的片，加入1000mL蒸馏水煮沸30min，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g，加热溶解后再补足蒸馏水至1000mL，自然pH，在121℃湿热蒸汽下高压灭菌30min，之后在超净工作台上倒平板，得到PDA培养基；PD培养基及制备方法：称取200g马铃薯，洗净去皮切片，加水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加蒸馏水补足至1000mL，再加12g葡萄糖，煮沸至固体充分溶解后分装到三角瓶中，于121℃湿热蒸汽下高压灭菌20min，得到PD培养基。本专利技术具有以下有益效果：1、棘孢曲霉Aa19从设施蔬菜根际土壤分离获得，对蔬菜作物安全，且对豇豆枯萎病具有防治作用，可用于设施蔬菜土传病害的防治。2、棘孢曲霉Aa19稳定性好，防效较高，连续10代继代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1抑菌效果稳定在68％以上，田间盆栽防效达到69.43％，适合设施蔬菜土传病害防治要求。3、棘孢曲霉Aa19防治设施蔬菜土传病害，使用方法简单，只需将菌株进行发酵培养，然后取发酵滤液对作物灌根即可，使用方便。附图说明序列表SEQIDNO:1是棘孢曲霉Aa19的18SrDNA序列。图1：棘孢曲霉Aa19菌落形态及分生孢子和分生孢子梗形态。图2：棘孢曲霉Aa19的18SrDNA-ITS系统发育树。图3：棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病的防治效果。附图标记说明：图3中的A为棘孢曲霉Aa19发酵滤液处理组；图3中的B为对照组(仅接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1)。具体实施方式实施例1候选菌株的分离与鉴定A、土样的采集2017年7月在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖基地土传病害发生严重的地块，采用5点取样法，取地下15-20cm处土样，采集设施蔬菜作物根际土壤，自然风干后保存备用；B、候选菌株的分离纯化称取5g土样倒入三角瓶中，加无菌水至50mL，28℃振荡30min后静置，即为10-1土壤悬液；再从上述溶液中取出1mL，加入9mL无菌水充分振荡制成10-2的土壤稀释液，吸取100μL稀释液涂于马丁氏培养基(配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，孟加拉红0.03g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)Aa19，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018648。

【技术特征摘要】
1.一种分离的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)Aa19，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018648。2.如权利要求1所述的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)Aa19在防治蔬菜土传病害豇豆枯萎病中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征包括以下步骤：A、以豇豆枯萎病菌作为指示菌用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(FusariumoxysporumSchl.)JWS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014314；B、棘孢曲霉Aa19稳定性的测定在PDA培养基平板上对棘孢曲霉Aa19进行连续10代的继代培养，以豇豆枯萎病菌JWS-1为指示菌，采用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性；C、棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性的测定取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种，加入适量的无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，采用血球计数法在显微镜下检查棘孢曲霉Aa19的孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴仁锋，申君，杨绍丽，叶安华，陈峰，
申请(专利权)人：武汉友芹种苗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42