一种氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶及在拆分环氧氯丙烷中的应用，所述酶将氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶溶于0.2M、pH8.0、磷酸盐缓冲液中，混匀后于0‑15℃，600rpm反应3‑30h，蒸馏水透析，取截留液用体积浓度50％乙醇水溶液沉淀，取沉淀，获得聚蔗糖修饰的环氧化物水解酶；本发明专利技术通过聚蔗糖对环氧化物水解酶进行化学修饰，环氧化物水解酶的比活力和热稳定性得到大幅度提高，在光学纯环氧化物的酶法制备应用中前景广阔。该酶生产方法简便，成本较低，具有广阔的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶及应用(一)
本专利技术涉及一种同时提高环氧化物水解酶比酶活和热稳定性的方法，尤其是一种利用聚蔗糖修饰环氧化物水解酶的化学修饰方法。(二)
技术介绍
手性环氧化物是一类重要的手性合成砌块，在医药、化工、材料、农药等其领域应用广泛。化学法生产手性环氧化物存在金属催化剂成本高、副产物多、环境污染严重等问题。生物催化法具有选择性高、成本较低、副产物少和绿色环保等优点，具有良好的发展前景和应用价值。环氧化物水解酶(Epoxidehydrolase,EH,EC3.3.2.3)能立体选择性地水解拆分外消旋环氧化合物，从而获得具有光学性质的环氧化物和相应的1,2-二醇。该酶来源广，普遍存在于大自然中，在许多生物体内都能找到，如植物、昆虫、哺乳动物和细菌等。但是，环氧化物水解酶普遍存在活力低、易变性、稳定性差等问题，直接影响到该酶在工业上的应用的生产效率和生产成本。化学修饰是提高酶稳定性的一种非常有效的方法，糖基的存在会增加蛋白质的刚度，并影响蛋白质的正确折叠及其构象。糖基还会对蛋白质的药理学性质，如生物学活性、免疫原性、受体结合能力等。由于糖类是高度亲水的，可以稳定蛋白质周围的水化层，促进新氢键的形成。另外，通过结合糖类将潜在的切割位点掩藏到结构内部，避免蛋白质水解攻击。由此可见，糖基对提高蛋白质自身的稳定性也有重要作用。近年来，研究者虽然已经发掘了多种能产环氧化物水解酶的微生物，如Pseudomonas、Rhodococcus、Agrobacterium、Xanthobacter、Chryseomonas、Chaetomiumglobosum、Cunning-hamella、Alentaria、Pleurotus、Rhodotorula等，环氧化物水解酶也被运用于不对称拆分外消旋环氧氯丙烷来生成手性环氧氯丙烷。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶及其同时提高环氧化物水解酶相对酶活和热稳定性的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，所述酶按如下方法制备：(1)氧化聚蔗糖：将聚蔗糖溶于0.25MNaIO4水溶液中，37℃、150rpm避光反应6h，加入乙二醇终止反应，将反应液在蒸馏水中透析，将透析后的截留液冻干，获得氧化聚蔗糖；所述NaIO4水溶液体积用量以聚蔗糖质量计为5-50mL/g(优选40mL/g)；(2)将氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶溶于0.2M、pH8.0、磷酸盐(PBS)缓冲液中，混匀后于0-15℃，600rpm反应3-30h(优选4℃，600rpm下反应16h)，蒸馏水透析(透析袋截留分子量为14kDa，透析24h，12h换一次透析液)，取截留液用体积浓度50％乙醇水溶液沉淀，取沉淀，获得聚蔗糖修饰的环氧化物水解酶；所述氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶质量比为0.5-500:1，优选15：1。进一步，步骤(2)所述环氧化物水解酶酶活为10～1000U/mg，优选200U/mg。进一步，步骤(1)所述聚蔗糖的分子量为70-700kDa，优选400kDa。进一步，步骤(1)所述透析时间为24h，间隔12h更换一次透析液，所述透析袋截留分子量为14000Da。进一步，步骤(2)所述环氧化物水解酶是将含环氧化物水解酶的菌株经发酵培养后的湿菌体分离提取获得的酶液，所述含环氧化物水解酶的菌株包括黑曲霉(Aspergillusniger)，放射性土壤农杆菌(Agrobacteriumradiobacter)，粘红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)及其重组大肠杆菌(Escherichiacoli)。进一步，所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。进一步，步骤(2)所述磷酸盐缓冲液体积用量以环氧化物水解酶质量计为0.1～10，优选0.3ml/mg。进一步，所述环氧化物水解酶按如下方法制备：(1)湿菌体：将含环氧化物水解酶基因的菌株(优选黑曲霉CCTCCM2010275)接种至斜面培养基，在37℃培养12h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的发酵培养基中，在37℃恒温培养至OD600等于0.6-0.8后，加入终浓度0.1mM的IPTG，在28℃下培养12h，对发酵液进行离心，收集湿菌体。发酵培养基终浓度组成：蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；(2)环氧化物水解酶的分离纯化取步骤(1)制备的湿菌体于pH8.0、200mMPBS缓冲液中悬浮，震荡摇匀后置于超声波(功率为300W)下破碎，超声频率1s间歇1s，破碎时间为20min；破碎液于10000r/min，4℃条件下离心10min去除细胞碎片，所得上清液即为粗酶液；将获得的粗酶液用Ni-NTA进行纯化，先用上样缓冲液(20mMPBS缓冲液，500mMNaCl和20mM咪唑，pH8.0)平衡Ni-NTA柱30min，接着上样粗酶液，然后用上样缓冲液以1mL/min的速度洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mMPBS缓冲液，500mMNaCl和500mM咪唑，pH8.0)以1mL/min的速度洗脱收集目标蛋白。整个过程中始终保持流速为1mL/min。酶液在20mM，pH8.0，0℃的PBS缓冲液中透析过夜，取截留液冻干，获得纯化的环氧化物水解酶。本专利技术还提供一种所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶在拆分环氧氯丙烷中的应用，所述应用方法为：以pH8.0、0.2M的PBS缓冲液为反应介质，以氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶为催化剂、以外消旋环氧氯丙烷为底物构成反应体系，在温度35℃、转数100rpm下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-环氧氯丙烷；所述反应体系中，底物终浓度800mM，催化剂用量为100～1000U/ml，优选350U/ml。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术通过聚蔗糖对环氧化物水解酶进行化学修饰，环氧化物水解酶的比活力和热稳定性得到大幅度提高，在光学纯环氧化物的酶法制备应用中前景广阔。该酶生产方法简便，成本较低，具有广阔的工业应用前景。当底物环氧氯丙烷浓度为800mM时，聚蔗糖(400kDa)修饰的环氧化物水解酶能将环氧氯丙烷拆分完全，反应30分钟后，(R)-环氧氯丙烷对映体过量值(ee值)可达99％以上；而未修饰的原始酶在此高底物浓度下反应10分钟后即完全失活，最终(R)-环氧氯丙烷ee值小于10％。这说明聚蔗糖修饰提高了环氧化物水解酶对高浓度底物的耐受性和催化活力。(四)附图说明图1不同种类或分子量多糖修饰环氧化物水解酶比活力柱形图。图2不同种类或分子量多糖修饰环氧化物水解酶的热稳定性柱形图。图3聚蔗糖(400kDa)修饰环氧化物水解酶与原酶的最适温度曲线；▲:修饰酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于所述酶按如下方法制备：(1)氧化聚蔗糖：将聚蔗糖溶于0.25M NaIO4水溶液中，37℃、150rpm避光反应6h，加入乙二醇终止反应，将反应液在蒸馏水中透析，将透析后的截留液冻干，获得氧化聚蔗糖；所述NaIO4水溶液体积用量以聚蔗糖质量计为5‑50mL/g；(2)将氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶溶于0.2M、pH8.0磷酸盐缓冲液中，混匀后于0‑15℃、600rpm反应3‑30h，用蒸馏水透析，取截留液用体积浓度50％乙醇水溶液沉淀，取沉淀，获得聚蔗糖修饰的环氧化物水解酶；所述氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶质量比为0.5‑500:1。

【技术特征摘要】
1.一种氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于所述酶按如下方法制备：(1)氧化聚蔗糖：将聚蔗糖溶于0.25MNaIO4水溶液中，37℃、150rpm避光反应6h，加入乙二醇终止反应，将反应液在蒸馏水中透析，将透析后的截留液冻干，获得氧化聚蔗糖；所述NaIO4水溶液体积用量以聚蔗糖质量计为5-50mL/g；(2)将氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶溶于0.2M、pH8.0磷酸盐缓冲液中，混匀后于0-15℃、600rpm反应3-30h，用蒸馏水透析，取截留液用体积浓度50％乙醇水溶液沉淀，取沉淀，获得聚蔗糖修饰的环氧化物水解酶；所述氧化聚蔗糖和环氧化物水解酶质量比为0.5-500:1。2.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于步骤(1)所述聚蔗糖的分子量为70-700kDa。3.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于步骤(1)所述透析时间为24h，间隔12h更换一次透析液，所述透析袋截留分子量为14000Da。4.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于步骤(2)所述环氧化物水解酶酶活为10～1000U/mg。5.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于步骤(2)所述环氧化物水解酶是由含环氧化物水解酶基因的菌株经发酵培养获得的湿菌体分离提取的纯酶；所述菌株包括黑曲霉(Aspergillusniger)、放射性土壤农杆菌(Agrobacteriumradiobacter)或粘红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)。6.如权利要求5所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。7.如权利要求1所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于步骤(2)所述磷酸盐缓冲液体积用量以环氧化物水解酶质量计为0.1-10mL/mg。8.如权利要求5所述氧化聚蔗糖修饰环氧化物水解酶，其特征在于所述环氧化物水解酶按如下方法制备：(1)湿菌体：将含环氧化物水解酶基因的菌株接种至斜面培养基，在37℃培养12h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹树平，郑裕国，轩秀玲，王之见，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33