一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体公开了一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法。本发明专利技术分别优化了鲎C因子酶原、B因子酶原和凝血酶原基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1～3所示；还优化了共同表达三种因子的核苷酸序列，如SEQ ID NO:4所示；并成功构建了单独表达或共同表达三种因子的真核表达载体，将上述真核表达载体分别转化进不同的工程细胞中进行表达，成功获得了类似天然鲎试剂的重组鲎试剂，可用于检测内毒素。所述试剂灵敏度高，特异性强，可降低假阳性，且制备工艺简单，无需分别提取纯化表达的蛋白，生产成本低，同时大大减少对野生鲎资源的需求，具有广阔的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法
本专利技术涉及基因工程
，具体地，涉及一种特异性检测内毒素的试剂及其制备方法。
技术介绍
鲎的血细胞溶解物可被微量的细菌内毒素或微量的真菌细胞壁成分(1-3)-β-D-葡聚糖激活产生一系列的酶促反应最终形成凝胶，该反应的机理如图1所示。美国科学家Bang和Levin于上世纪六十年代发现鲎血的凝集机理并建立了鲎实验方法。药典收载细菌内毒素检查法后，鲎试剂得以广泛的应用和进入工厂化生产；其中以美国的产量最大，质量和标准最高，产品的技术含量也最高。医药工业对于鲎试剂的依赖程度越来越高，消耗鲎试剂的量逐年上升。但由于我国南方大肆捕杀食用鲎，鲎生存环境的逐步恶化已使其濒临灭绝，造成鲎试剂原料供应出现紧张。目前，生产鲎试剂仍依赖从鲎提取的血细胞溶解物，经氯仿抽提后冷冻干燥制备而成。这种方法制备的鲎试剂具有难以克服的缺陷：①鲎试剂灵敏度差异较大。由于鲎的个体差异大和目前鲎试剂的生产工艺的不同，生产的鲎试剂灵敏度差异较大。②鲎试剂缺乏特异性。因为鲎凝血过程具有两条不同的激活途径，所以这种制备鲎试剂的工艺不能保证生产出来的鲎试剂具有特异性，也就造成实际应用鲎试剂检测时会出现假阳性结果，不易区分是内毒素引起的鲎反应还是(1-3)-β-D-葡聚糖引起的鲎反应。③不符合临床检测需要。由于鲎试剂缺乏特异性，因而限制了其在临床上的推广使用。鲎试剂的特异性是当前鲎试剂生产
亟待解决的问题，同时也是药品质量控制、降低生产成本、减少鲎试验假阳性结果的要求。目前，国外用基因工程技术克隆表达了C因子，成功制备了特异性检测内毒素的鲎试剂。国内张惟杰等用大肠杆菌已经成功克隆制备重组鲎凝血C因子，但因大肠杆菌本身就产内毒素，所以该法获得的C因子是被激活的C因子，不能用于鲎试剂的制备。C因子实际是一个糖蛋白，不适合用原核表达系统表达，国内未见重组C因子用于检测细菌内毒素的报告。此外，目前国外基因工程技术生产的C因子制备的检测试剂仍存在灵敏度不高、生产成本高、检测结果不能完全与天然鲎试剂一致等缺点。因此，现急需研究一种灵敏度高、特异性强的人工鲎试剂及其相应的制备方法，以缓解鲎资源短缺，满足内毒素检测的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有方法制备的鲎试剂灵敏度及特异性较低，鲎资源有限的缺陷，提供一种特异性检测内毒素的试剂。本专利技术首先对鲎C因子酶原基因、B因子酶原基因和凝血酶原基因的核苷酸序列进行密码子优化，然后成功构建了单独表达或共同表达上述三种密码子优化后的酶原基因的真核表达载体，再将上述真核表达载体分别转化进不同的工程细胞中进行真核表达，成功获得了类似天然鲎试剂的重组鲎试剂，可用于检测内毒素，具有灵敏度高、特异性强的优点。本专利技术的另一目的在于提供一种表达鲎C因子酶原的重组基因。本专利技术的另一目的在于提供一种表达鲎B因子酶原的重组基因。本专利技术的另一目的在于提供一种表达鲎凝血酶原的重组基因。本专利技术的另一目的在于提供一种共表达鲎C因子、B因子和凝血酶原的重组基因。本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述任一所述的重组基因的真核表达载体。本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述真核表达载体的宿主细胞。本专利技术的另一目的在于提供上述重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备检测内毒素的试剂中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种特异性检测内毒素的试剂的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一种表达鲎C因子酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。一种表达鲎B因子酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。一种表达鲎凝血酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。一种共表达鲎C因子、B因子和凝血酶原的重组基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术通过对鲎C因子酶原基因、B因子酶原基因和凝血酶原基因的核苷酸序列进行密码子优化，其优化后的序列分别如SEQIDNO:1～3所示，并成功构建了单独表达或共同表达(SEQIDNO:4)上述三种密码子优化后的酶原基因的真核表达载体，通过将上述真核表达载体分别转化进不同的工程细胞中进行真核表达，成功获得了类似天然鲎试剂的重组鲎试剂，可用于检测内毒素。本专利技术还请求保护一种真核表达载体，含有上述任一所述的重组基因。本专利技术还请求保护一种宿主细胞，含有上述真核表达载体。所述的宿主细胞的制备方法，包括如下步骤：将上述任一所述的重组基因装载入真核表达载体中，再将真核表达载体导入动物细胞中并采用抗生素筛选能分别稳定表达C因子、B因子、凝血酶原的细胞或能稳定共表达三种因子的细胞，即得。优选地，所述真核表达载体为哺乳类表达载体或昆虫表达载体。更优选地，所述真核表达载体为含有CMV启动子的pcDNA3.1载体。优选地，所述动物细胞为COS细胞系、CHO细胞系或其他能利用CMV启动子的细胞系。本专利技术还请求保护上述任一所述的重组基因或真核表达载体或宿主细胞在制备检测内毒素的试剂中的应用。一种特异性检测内毒素的试剂的制备方法，先构建单独表达SEQIDNO:1～3所示重组酶原基因的真核表达载体，然后分别导入动物细胞中，筛选得到稳定表达上述三个基因的细胞；再将筛选到的三种细胞扩增、漂洗后混匀，得细胞混合液；最后将细胞混合液裂解、离心，收集上清液；加入等体积冰冷氯仿，离心后取上清液，即得；或构建SEQIDNO:4所示重组酶原基因的真核表达载体，然后导入动物细胞中，筛选得到稳定表达上述重组基因的细胞，将筛选到的细胞扩增、漂洗后再裂解、离心，收集上清液；加入等体积冰冷氯仿，离心后取上清液，即得。本专利技术还请求保护所述方法制备得到的特异性检测内毒素的试剂，含有SEQIDNO:1～3所示重组基因的表达产物或含有SEQIDNO:4所示重组基因的表达产物。优选地，所述试剂还含有无内毒素水、终浓度为0.06～0.2％的氯化钠、终浓度为0.15～0.6M的氯化钙、终浓度为0.2～0.5M的氯化镁和终浓度为5～10％的右旋糖酐。作为一种优选的具体实施方式，所述特异性检测内毒素的试剂的制备方法包括如下步骤：S1.分别将3个关键因子(C因子酶原、B因子酶原、凝血酶原)的基因序列装载入含有CMV启动子的真核表达载体中，然后分别导入动物细胞中，并根据载体所携带的抗性基因使用抗生素筛选分别稳定表达上述3个关键因子的细胞；S2.将S1所得细胞进行细胞扩增，当细胞扩增到汇合度达90％时，分别收集3种细胞，用无内毒素的生理盐水或缓冲液漂洗三次，计数；然后将三种细胞按照以下数量比例混合，即表达C因子酶原的细胞数目：表达B因子酶原的细胞数目：表达凝血酶原的细胞数目＝1:2～5:10～25；S3.用无内毒素水裂解细胞混合液，于10000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，按体积比(细胞裂解液:氯仿＝1:0.6～2)加入相应体积的氯仿，于3～10℃下剧烈振摇10～30min，于5000g、4℃下离心5～10min，收集上清液，上清液即人工制备的特异检测内毒素的试剂原液，加入氯化钠使之终浓度为0.06～0.2％，CaCl2终浓度为0.15～0.6M，MgCl2终浓度为0.2～0.5M，再加入右旋糖酐为赋形剂，右旋糖酐的终浓度为5～10％，混匀，分装0.1～1mL/支安培瓶，冷冻干燥，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达鲎C因子酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种表达鲎C因子酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种表达鲎B因子酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种表达鲎凝血酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。4.一种共表达鲎C因子、B因子和凝血酶原的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。5.一种真核表达载体，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述的重组基因。6.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求5所述的真核表达载体。7.权利要求1～4任一所述的重组基因或权利要求6所述的真核表达载体或权利要求6所述的宿主细胞在制备检测内毒素的试剂中的应用。8.一种特异性检测内毒素的试剂的制备方法，其特征在于，先构建单独表达SEQIDNO:1～3所示重组基因的真核表...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海涛，伍俊，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44