本发明专利技术公开一种从中药提取物中定向分离出抗内毒素活性单体的方法，该方法包括如下步骤：中药提取物上大孔吸附树脂柱，用乙醇-水梯度洗脱，分别检测洗脱得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到结合活性最高的组分A1；组分A1上聚酰胺柱，用乙醇-水梯度洗脱，分别检测洗脱得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到结合活性最高的组分B1；组分B1采用高效液相色谱法分离，分别检测分离得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到所述抗内毒素活性单体。本发明专利技术利用抗内毒素活性单体与Lipid A具有高结合活性的特点，逐级分离出目标组分，从而实现活性单体的富集、纯化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药
，具体涉及一种从中药提取物中定向分离药物活性单体特别是抗内毒素活性单体的方法。
技术介绍
脓毒症的防治是临床亟待解决的难题，从天然药物中筛选并分离提取具有拮抗细菌主要致炎分子(如:G_菌的内毒素(LPS)，是引起脓毒症的主要启动子)的单体化合物是解决这一难题的新策略。研宄表明，LPS通过其活性中心Lipid A (类脂A)与髓样单核细胞膜上的⑶14结合，进而与TLR4受体结合是其发挥生物学活性的主要途径，因此，阻断LPS与受体的结合是拮抗LPS导致脓毒症的关键环节之一。中医中药在我国具有得天独厚的条件和丰富的资源，中医药在治疗脓毒症方面具有悠久历史。根据临床表现，脓毒症在中医理论中属于温病、热症等范畴。中医用药的原则是“辨证论治”，故又“同病异治”或“异病同治”等法则。就中药的性而言，又有“热者寒之”，“寒者热之”等用药原则。这就可以认为在诸多寒性或热性药物中，必然有共同的物质基础，即相关的化学成分。现代研宄认为，中药的清热解毒功效主要是由于其有效成分的抗LPS作用和抗病原微生物作用。通过对中草药抗LPS作用的研宄，现已发现多种中草药具有较好的拮抗LPS作用:金银花、连翘、黄芩、青蒿等20余种单味中药具有体外抗菌、抗LPS作用；由丹参、大黄、甘草等中药组成的方剂能够显著抑制LPS刺激的巨噬细胞活化；金银花、板兰根、赤芍、连翘、黄芩等单味中药具有降低LPS活性的作用，但是从中草药中分离到具有较好拮抗LPS作用的单体的报道却甚少。宄其原因，一方面可能由于中药组成成分极其复杂，分离过程繁琐；另一方面则由于受技术手段的限制，无法对分离得到的组分进行活性检测与跟踪。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从中药提取物中定向分离出抗内毒素活性单体的方法。本专利技术实现上述目的所采用的技术方案如下: 一种从中药提取物中定向分离出抗内毒素活性单体的方法，包括如下步骤: (1)中药提取物上大孔吸附树脂柱，用乙醇-水梯度洗脱，分别检测洗脱得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到结合活性最高的组分Al ; (2)将步骤(I)得到的组分Al上聚酰胺柱，用乙醇-水梯度洗脱，分别检测洗脱得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到结合活性最高的组分BI ; (3)步骤(2)得到的组分BI采用高效液相色谱法分离，分别检测分离得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到所述抗内毒素活性单体。进一步，在步骤(2)中，组分Al先用膜过滤除去分子量大于5000 Da的成分后再上聚酰胺柱。进一步，所述中药提取物为栀子水提取物。HPLC过柱分离时，采用甲醇-水梯度洗脱。本专利技术具有以下优点: 1.目标单体化合物分离具有靶向性:利用抗内毒素活性单体与Lipid A具有高结合活性的特点，收集与Lipid A具有较高结合活性的组分，从而实现目标活性组分的富集、纯化并最终获取活性单体化合物。2.目标单体化合物分离工艺安全:分离过程中主要以毒性低且极易挥发的乙醇作为溶媒或洗脱液，采用膜分离技术去除分子量大于5000 Da的淀粉、蛋白质和树脂等杂质或无效成分，最大限度的保留活性成分于超滤液中，利于HPLC的纯化，符合安全、有效、可控的药物研发原则。【附图说明】图1为FG_1~3与Lipid A的结合反应曲线； 图2为PA-1~3与Lipid A的结合反应曲线； 图3为PA-2a、PA-2b与Lipid A的结合反应曲线； 图4为PA-2a的HPLC图； 图5为PA-2a和栀子苷标准品的HPLC图； 图6为PA-2a和栀子苷标准品的紫外吸收光谱； 图7为PA-2a和栀子苷标准品的硅胶G薄层图。【具体实施方式】以下结合实施例和附图对本专利技术做进一步详细说明。实施例1 (I)栀子水提液上AB-8大孔吸附树脂柱进行层析，用乙醇-水梯度洗脱，具体操作为:栀子水提液以流速8?10 ml/min上样，上样结束后，分别以蒸馏水、10%乙醇和50%乙醇(V/V)，流速16?20 ml/min进行淋洗，分别收集淋洗液，依次产生3个组分，分别命名为FG-1 (蒸馏水洗组分)、FG-2 (10%乙醇洗组分)和FG-3 (50%乙醇洗组分)，各组分依次移入R1002型旋转蒸发仪烧瓶，减压浓缩，然后低温冷冻抽干，备用。以Lipid A为靶点，用生物传感器检测上述各组分与Lipid A的结合活性。FG-1-3与Lipid A的结合反应曲线如图1所示，其中以FG-3与Lipid A结合活性最高，RU值为65 arc seconds，因此，选择FG-3作进一步的分离。(2)依据中医理论，中药中分子量大于5000 Da的多为淀粉、蛋白质和树脂等杂质或无效成分，因此，将FG-3先用UF超滤膜分离成两个组分:截流组分(分子量大于5000Da)和滤液组分(分子量小于5000 Da)。将其中的滤液组分上聚酰胺柱进行层析，用乙醇-水梯度洗脱，具体操作为:上样后，分别以蒸馏水、20%乙醇、50%乙醇(V/V)进行洗脱，流速16ml/min,减压浓缩后负压抽干，备用。依次产生3个组分，分别命名为PA_1(蒸馏水洗组分)、PA-2 (20%乙醇洗组分)和PA-3 (50%乙醇洗组分)，以Lipid A为靶点，用生物传感器检测上述各组分与Lipid A的结合活性。PA-1?3与Lipid A的结合反应曲线如图2所示，其中以PA-2与Lipid A结合活性最高，RU值为68 arc seconds，因此，选择PA-2作进一步的分离。(3)步骤(2)得到的PA-2采用高效液相色谱(HPLC)分离，具体操作过程为: HPLC分析 PA-2组分冻干品用甲醇/水(28 / 72，V/V)配制成lmg/ml浓度，10 μ I进样，流速:Iml/min，检测波长 240nm ;色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18 (150*4.6mm，5 μ m)柱；柱温:25°C ;以甲醇(A)和水(B)作为流动相进行梯度洗脱:0~9min, A:B=28:72 ；9~50min,A:B=28:72 ~ 38:62，进行色谱分析。HPLC 制备 根据色谱分析条件对PA-2组分进行HPLC分离制备，检测波长240 nm ;色谱柱:KF_C18(200*20 mm，10 μm)柱；柱温:25°C ;流速:20 ml/min ;样品浓度:2 mg/ml ;进样体积:20ml，按各色谱峰保留时间顺序依次收集洗脱液，减压浓缩后负压抽干，备用。HPLC分离获得2个产物，保留时间分别为:10.589 min (命名为PA_2a)和23.857min(命名为PA-2b)，按步骤(I)的方法分别检测PA_2a和PA_2b与Lipid A的结合活性，结合反应曲线如图3所示，其中，以PA-2a与Lipid A的结合活性最高，RU值为112 arcseconds。HPLC分析(图4)显示:PA_2a为一对称的单峰，HPLC峰面积归一化法检测，PA_2a纯度大于99%，工作站峰纯度评估显示PA-2a的纯度因子为999.988，在阈值(990.000)范围内，以上综合分析说明PA-2a为单一物质。PA_2a 的鉴定 ①PA-2a与栀子苷标准品的HPLC、紫外全波长扫描和薄层本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从中药提取物中定向分离出抗内毒素活性单体的方法，所述方法包括如下步骤：（1）中药提取物上大孔吸附树脂柱，用乙醇‑水梯度洗脱，分别检测洗脱得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到结合活性最高的组分A1；（2）将步骤（1）得到的组分A1上聚酰胺柱，用乙醇‑水梯度洗脱，分别检测洗脱得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到结合活性最高的组分B1；（3）步骤（2）得到的组分B1采用高效液相色谱法分离，分别检测分离得到的各组分与Lipid A的结合活性，得到所述抗内毒素活性单体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：伏建峰，史清海，王晓军，冉继华，刘正祥，袁文常，葛迪，李晓玲，高婷，王黎，胡科研，
申请(专利权)人：中国人民解放军兰州军区乌鲁木齐总医院，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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