一种检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用技术

一种检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的黄樟素单克隆抗体，硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有黄樟素半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述黄樟素半抗原是由5‑(2‑溴‑2‑丙烯‑1‑基)‑1,3‑苯并二氧戊环与氨基丙酸反应得到的。本发明专利技术还提供了该试纸条的制备方法及应用上述试纸条检测样品中黄樟素的方法。本发明专利技术提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的优点，能够实现对大批量样品中黄樟素的快速检测和现场监控。

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
本专利技术属于食品安全中非法添加物检测领域，具体涉及一种检测烟用香精香料、烟草及烟草制品中黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
黄樟素又称黄樟油素、黄樟脑，无色或微黄色液体，不溶于水，易溶于氯仿、乙醚和其他非极性有机溶剂，有樟木气味，天然存在于肉桂、肉豆蔻、黑胡椒和紫苏等植物中，是许多食用天然精油如黄樟精油、八角精油和樟脑油的主要成分。由于其舒适的气味，黄樟油曾经在食品、洗涤用品和化妆品中作为调味剂和调香剂。黄樟素类化合物主要包括黄樟素、异黄樟素、二氢黄樟素等。黄樟素也是非法生产毒品摇头丸的一个重要组成部分。由于试验表明黄樟素对老鼠有致肝肿瘤的效果，因此，各国对黄樟素进行了限量规定。2001年，欧盟委员会规定黄樟素和异黄樟素的总使用限量，食品和饮料中为1mg/kg，含酒精饮料为5mg/kg。2005年，欧洲委员会将黄樟素列为怀疑弱致癌物质，虽然没有规定每日限量，但要求设置的尽可能低。我国于2005年实施的《易制毒化学品管理条例》将黄樟素列为第一类易制毒化学品。由于黄樟素类化合物的毒副作用，建立准确、快速、简便的黄樟素类化合物分析检测方法，对于评估食品、化妆品、烟草等安全性有着重要作用。目前，常用检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法等。由于以上方法均需先进检测仪器、检测费用昂贵、步骤繁琐、耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的高通量快速筛查检测。荧光微球免疫层析技术是在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，具有快速、操作简便等优点。相比传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上述检测方法，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、操作简便、检测快速、价格低廉的检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条；本专利技术的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法；本专利技术的再一个目的是提供上述试纸条在检测黄樟素中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采取的一个技术方案是：提供一种检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，它包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的黄樟素单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体。所述黄樟素单克隆抗体是以黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物是由黄樟素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述黄樟素半抗原是由5-(2-溴-2-丙烯-1-基)-1,3-苯并二氧戊环与氨基丙酸反应得到，其分子结构式为：。所述黄樟素半抗原的制备具体包括以下步骤：取5-(2-溴-2-丙烯-1-基)-1,3-苯并二氧戊环1.0g，加无水二甲基亚砜（DMSO）50mL溶解，搅拌澄清，加氢氧化钾0.48g，加无水碘化钠0.20g，剧烈搅拌后，加氨基丙酸0.41g，100℃反应4h。停止反应，加水50mL，加1mol/L盐酸调节pH值到6，加乙酸乙酯80mL，萃取三次，合并有机相，旋蒸蒸干，上硅胶柱，用体积比为1:5的乙酸乙酯/石油醚洗脱分离，得到半抗原产物丙酸黄樟素0.91g。所述荧光微球是直径为100~300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团，所述荧光物质为镧系。本专利技术采取的另一个技术方案是提供一种制备上述检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条的方法，它包括如下步骤：1）结合物释放垫的制备：用市售的荧光微球标记黄樟素单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将结合物释放垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备；2）硝酸纤维素膜的制备：将黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围，制成质控区；3）组装和剪切：在底板上依次搭接地粘贴样品吸收垫、包埋有荧光微球标记黄樟素单克隆抗体的结合物释放垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为时间分辨荧光免疫层析试纸条。具体地说，步骤包括：1）通过5-(2-溴-2-丙烯-1-基)-1,3-苯并二氧戊环与氨基丙酸反应，制备黄樟素半抗原；2）将黄樟素半抗原与载体蛋白偶联，制备黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物；3）用黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌黄樟素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5）分别将黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜的检测区范围（T）和质控区范围（C）；6）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；7）用市售的荧光微球标记黄樟素单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将结合物释放垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用；8）在底板上依次搭接粘贴样品吸收垫、包埋有荧光微球标记黄樟素单克隆抗体的结合物释放垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为时间分辨荧光免疫层析试纸条。本专利技术采取的另一个技术方案是提供一种上述检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条在检测黄樟素中的应用，它包括如下步骤：1）样品前处理；2）用所述的检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条进行检测；3）用荧光检测仪分析检测结果。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：（1）特异性强、灵敏度高：本试纸条采用将荧光微球标记的黄樟素单克隆抗体包埋在结合物释放垫上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，降低成本，增加整个体系的反应灵敏度。（2）时间分辨荧光具有较大stock位移，减少了由激发光引起的特异杂散光对检测的干扰，提高荧光检测稳定性；其寿命长，消除了环境中荧光物质对待测物的干扰；其激发波长较宽，发射光谱范围较窄，降低了本底荧光强度，提高了分辨率。（3）荧光微球表面包裹了聚苯乙烯，实现了对荧光物质镧系的保护，减少了外界环境的干扰，增加了荧光微球的稳定性及荧光寿命。（4）荧光微球表面修饰活性基团—COOH，采用化学偶联的方法来标记抗体，形成抗体与微球的稳定结合。目前尚无用于检测烟用香精香料及烟草制品中黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，本专利技术填补了该空白。本专利技术的试纸条具有成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：所述结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的黄樟素单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有黄樟素半抗原‑载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体；所述黄樟素单克隆抗体是以黄樟素半抗原‑载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述黄樟素半抗原‑载体蛋白偶联物是由黄樟素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述黄樟素半抗原是由5‑(2‑溴‑2‑丙烯‑1‑基)‑1,3‑苯并二氧戊环与氨基丙酸反应得到，其分子结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：所述结合物释放垫上包埋有荧光微球标记的黄樟素单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，所述检测区喷涂有黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体；所述黄樟素单克隆抗体是以黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述黄樟素半抗原-载体蛋白偶联物是由黄樟素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述黄樟素半抗原是由5-(2-溴-2-丙烯-1-基)-1,3-苯并二氧戊环与氨基丙酸反应得到，其分子结构式为：。2.如权利要求1所述的检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述黄樟素半抗原的制备反应过程如下：。3.根据权利要求1所述的检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧光微球是直径为100~300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团。4.根据权利要求3所述的检测黄樟素的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈黎，刘惠民，崔娜，曹东山，樊美娟，崔华鹏，赵乐，贾云祯，李行，尚平平，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41