木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用。本发明专利技术人鉴定到一个木聚糖酶专性转录调控因子SxlR，其是木聚糖酶专性的负调控因子。该基因敲除后的宿主菌中，木聚糖酶活提高而纤维素酶活不受影响。可通过调控该基因的表达或活性，达到提高宿主菌中木聚糖酶的水解效率的目的。

【技术实现步骤摘要】
木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用
本专利技术属于生物
，涉及一种木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用。
技术介绍
木质纤维素是地球上含量最为丰富的可再生资源，它主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其降解主要由以木霉属、曲霉属和青霉属为代表的丝状真菌完成。此外，木质纤维素降解酶也广泛用于食品、饲料、造纸和纺织等行业。里氏木霉是工业上常用的纤维素酶和半纤维素酶生产菌，也常用作异源蛋白表达宿主。随着纤维素乙醇需求的逐年增加，里氏木霉来源纤维素酶的需求也与日俱增，然而纤维素酶的产量和配比仍是阻碍其广泛应用的重要难题，因此，研究者需要进一步提高里氏木霉纤维素酶对底物的降解效率并降低其生产成本。由于木质纤维素组成和结构复杂，因此需要在里氏木霉产纤维素酶的基础上额外添加其他来源的酶从而提高其对木质纤维素的降解效率。例如，丹尼斯克和诺维信生产的商品化纤维素酶就需要额外添加半纤维素酶和辅助性酶。这表明，在里氏木霉中提高以木聚糖酶为主要代表的半纤维素酶可有效提高其对木质纤维素底物的降解效率。里氏木霉中纤维素酶和半纤维素酶的转录受到严格调控，因此可尝试通过敲除或过表达木聚糖酶专性的转录调控因子从而提高其木聚糖酶活。然而，现在绝大多数已知的转录调控因子都同时调控纤维素酶和半纤维素酶(木聚糖酶)。里氏木霉中研究最广泛的转录调控因子是负调控因子Cre1，它主要介导碳阻遏效应，即在以葡萄糖等易于利用的碳源条件下，纤维素酶和半纤维素酶基因转录受到抑制。Xyr1是里氏木霉中全局性转录激活因子，它调控绝大多数纤维素酶和半纤维素酶基因的转录。其余转录调控因子还包括正调控因子ACEII和Hap2/3/5复合体，负调控因子ACEI。此外，BglR是新鉴定到的β-葡萄糖苷酶专性转录激活因子，潜在的甲基转移酶Lae1也被证明对纤维素酶和半纤维素酶合成必不可少。ACEIII是新鉴定到与纤维素酶和半纤维素酶产生必需的转录调控因子。最近有研究发现，里氏木霉的非整倍体转化子在以木聚糖为碳源的培养基上生长更好，同时木聚糖酶活更高。进一步研究发现，非整倍体转化子中的D片段的加倍而不是L片段的缺失是其木聚糖酶活提高的原因，同时其纤维素酶活不受影响。因此，里氏木霉中应该存在潜在的木聚糖酶专性转录调控因子。因此，在里氏木霉中发掘木聚糖酶专性转录调控因子显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种木聚糖酶专性转录抑制因子及其在里氏木霉改造中的应用。在本专利技术的第一方面，提供一种提高产生木聚糖酶的宿主菌中的木聚糖酶活性的方法，所述方法包括：在所述的产生木聚糖酶的宿主菌中下调木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的表达或活性。在一个优选例中，所述下调木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的表达或活性包括：敲除或沉默木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因，或抑制木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的活性。在另一优选例中，通过采用同源重组的方法，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因；或通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因。在另一优选例中，通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因；较佳地，所述的基因编辑的靶位点序列选自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7。在另一优选例中，通过采用特异性干扰木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因表达的干扰分子来沉默木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因。在另一优选例中，所述的干扰分子是以木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。在另一优选例中，所述的产生木聚糖酶的宿主菌是含有木聚糖酶专性转录调控因子SxlR或其同源酶的宿主菌；较佳地，所述的产生木聚糖酶的宿主菌包括但不限于：里氏木霉(Trichodermareesei)，草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。在另一优选例中，所述的木聚糖酶专性转录调控因子SxlR选自下组：(a)如SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQIDNO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。在本专利技术的另一方面，提供一种产生木聚糖酶的宿主菌，所述宿主菌中，木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的表达或活性被下调。在一个优选例中，所述宿主菌中，木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因被敲除；或所述宿主菌中，存在特异性干扰木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因表达的干扰分子。在本专利技术的另一方面，提供一种制备所述的产生木聚糖酶的宿主菌的方法，通过采用同源重组的方法，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因，获得所述的宿主菌；或通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因，获得所述的宿主菌。在本专利技术的另一方面，提供一种制备所述的产生木聚糖酶的宿主菌的方法，通过采用特异性干扰木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因表达的干扰分子来沉默木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因。在一个优选例中，还在所述的产生木聚糖酶的宿主菌中，上调(包括外源表达或过表达)正调控因子，或下调负调控因子。在另一优选例中，所述的正调控因子包括但不限于：木聚糖酶基因，xyr1，lae1，ace2，ace3。在另一优选例中，所述的负调控因子包括但不限于：cre1，ace1。在本专利技术的另一方面，提供前面所述的产生木聚糖酶的宿主菌的用途，用于水解木聚糖酶底物；较佳地，所述的木聚糖酶底物包括但不限于：木质纤维素底物，桦木木聚糖，山毛榉木聚糖。在本专利技术的另一方面，提供一种水解木质纤维素底物的方法，所述方法包括：以所述的产生木聚糖酶的宿主菌处理所述的木质纤维素底物。在一个优选例中，所述的木质纤维素底物包括但不限于：玉米秸杆、玉米芯、稻草、稻杆、稻壳、麦秸杆、高粱杆、木糖渣、甘蔗渣或其组合；较佳地，所述木质纤维素底物是经过汽爆处理的木质纤维素底物。在本专利技术的另一方面，提供sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸的用途，用于与Cas9mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转入产生木聚糖酶的宿主菌中；其中，所述的sgRNA靶向木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因。在一个优选例中，所述的sgRNA靶向于SEQIDNO:1序列中的片段，所述片段选自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高产生木聚糖酶的宿主菌中的木聚糖酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括：在所述的产生木聚糖酶的宿主菌中下调木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的表达或活性。

【技术特征摘要】
1.一种提高产生木聚糖酶的宿主菌中的木聚糖酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括：在所述的产生木聚糖酶的宿主菌中下调木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的表达或活性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下调木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的表达或活性包括：敲除或沉默木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因，或抑制木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的活性。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过采用同源重组的方法，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因；或通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因；较佳地，所述的基因编辑的靶位点序列选自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过采用特异性干扰木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因表达的干扰分子来沉默木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因；较佳地，所述的干扰分子是以木聚糖酶专性转录调控因子SxlR的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的产生木聚糖酶的宿主菌是含有木聚糖酶专性转录调控因子SxlR或其同源酶的宿主菌；较佳地，所述的产生木聚糖酶的宿主菌包括：里氏木霉(Trichodermareesei)，草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的木聚糖酶专性转录调控因子SxlR选自下组：(a)如SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQIDNO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，刘睿，邹根，陈玲，江艳萍，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31