用于分析离子通道的活性的方法技术

本发明专利技术涉及一种分析离子通道(3)的活性的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在疏水介质(1)中提供水溶液AS1的第一液滴，所述水溶液AS1包含浓度q的离子I，其中c1≥0，其中液滴D1被单层的两亲分子(2)包围，(ii)在所述疏水介质(1)中提供水溶液AS2的第二液滴D2，所述水溶液AS2包含浓度c2的离子I，其中c1≥0且c2≠c1，其中液滴D2被单层的两亲分子(2)包围，所述单层的两亲分子(2)进一步包含待分析的离子通道(3)，(iii)将第一液滴D1和第二液滴D2接触以在接触区域中形成双层的两亲分子(2)，其中双层的两亲分子(2)进一步包含待分析的离子通道(3)，测量两个液滴在称为初始状态的接触时的半径，和(iv)保持第一液滴D1和第二液滴D2接触直至达到平衡，并测量两个接触的液滴的半径或确定在称为平衡状态的平衡时产生的液滴的数量，其中当至少一个液滴在其初始状态和其平衡状态之间的半径差为至少10％或在平衡状态下仅获得一个液滴时，离子通道(3)是非活性的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分析离子通道的活性的方法
本专利技术涉及一种用于分析离子通道的活性的方法，该方法可用于进行高通量筛选(HTS)。
技术介绍
离子通道是成孔膜蛋白，其允许离子流过细胞膜。离子通道存在于所有细胞的膜中并构成基本的药理学药物靶标，以特别地开发止痛药、抗惊厥药、抗心律失常药、抗癌药、癫痫治疗药、听力障碍治疗药、抗炎药和神经肌肉阻滞剂。它们通常特定于一种类型的离子。开发用于测量离子通道的活性的第一种方法基于活细胞记录。这种方法通常需要过度表达感兴趣的离子通道，这改变了细胞生理状态，对通道活性产生不可预测的后果。这在许多情况下导致对细胞的毒性及其细胞凋亡。在这些方法中，主要通过膜片钳或荧光来测量离子通道的活性。膜片钳系统涉及基于电生理学的测量。将电极浸入细胞中，参比电极在含有细胞的溶液的外部。当离子通过通道时，在膜上产生电流并通过电极进行测量。如果通道是非功能性的或被化合物阻塞，则将不会记录到电流。基于荧光的系统使用离子特异性(或pH依赖性)荧光分子。然而，尚未对于所有离子均存在这种离子特异性荧光分子。为了克服基于细胞的方法的缺点，还开发了基于膜片钳或荧光测量的无细胞方法。在这些无细胞方法中，离子通道在模型膜(例如液滴界面双层(DIB))，可能地在微流体平台中(Schlicht和Zagnoni2015)表达、纯化和重构(Bayley等2008；Barriga等2014；Villar等2011；WO2008/012552)。这种DIB尤其可以在由单层的两亲分子包围的液滴以及用单层的两亲分子覆盖的平面基底之间的界面处产生(US2012/0220481)或在由单层的两亲分子包围的两个液滴之间的界面处产生(US8,268,627；US8,293,339；US8,506,905)。必须仔细选择形成膜的脂质，以使通道正确折叠。为了发现针对离子通道的新型药物化合物(如止痛药、抗惊厥药、抗心律失常药、抗癌药、癫痫药、听力障碍药、抗炎药或神经肌肉阻滞剂)，能够通过自动化，高通量测定筛选多种化合物的化学库是有用的。然而，现有技术已知的基于细胞的或无细胞的方法具有不利于高通量筛选(HTS)的限制。实际上，大多数当前的HTS方法涉及通常在微流体或毫流体设备中流动的化合物。因此，由于使用电极，这排除了膜片钳方法的使用。使用基于荧光的方法也是不方便的，因为在荧光化合物的流动下观察到荧光涂片，其基本上产生噪声并限制读出。提高药物发现率的一个挑战是提供一种允许在高通量筛选方法中测量离子通过膜嵌入通道的方法。因此，需要一种用于以高通量方式分析具有良好读出的离子通道活性的方法。
技术实现思路
因此，本专利技术的专利技术人开发了一种电极和无荧光方法，其中通过简单光学检测装置(例如照相机，特别是在透射光或明场中)分析离子通道活性，从而克服了现有技术方法的问题，并因此允许在高通量筛选中使用该方法。因此，本专利技术涉及一种分析离子通道(3)的活性的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在疏水介质(1)中提供水溶液AS1的第一液滴D1，所述水溶液AS1包含浓度c1的离子I，其中c1≥0，其中液滴D1被单层的两亲分子(2)包围，(ii)在所述疏水介质(1)中提供水溶液AS2的第二液滴D2，所述水溶液AS2包含浓度c2的离子I，其中c2≥0且c2≠c1，其中液滴D2被单层的两亲分子(2)包围，所述单层的两亲分子(2)进一步包含待分析的离子通道(3)，(iii)将第一液滴D1和第二液滴D2接触以在接触区域中形成双层的两亲分子(2)，其中双层的两亲分子(2)进一步包含待分析的离子通道(3)，和(iv)测量两个接触的液滴的尺寸或确定在平衡时产生的液滴的数量。因此，液滴D1和D2保持接触直至达到平衡。当将液滴接触时，还测量两个接触的液滴的尺寸，从而能够在液滴接触(初始状态)和处于平衡(平衡状态)时比较液滴的尺寸/数量。附图说明将参考附图通过实施例来描述本专利技术。图1a示出了根据本专利技术的方法的步骤(iii)，其涉及包含待测试的离子通道(3)的双层的两亲分子(2)的形成。图1b示出了获得的双层的两亲分子(2)，其包含在液滴D1和D2之间的离子通道(3)。图2示出了根据本专利技术的整个方法，仅表示了液滴D1和液滴D2。图3示出了在c2>c1和离子通道(3)为活性的情况下，水和离子I通过包含待测离子通道(3)的双层的两亲分子(2)的转移。图4a示出了在离子通道(3)为非活性的情况下，液滴D1和液滴D2随时间(在5分钟的时间段上)的变化。起始浅灰色液滴不含离子I，而起始深灰色液滴含有离子I(例如K+)。图4b示出了在离子通道(3)为非活性的情况下，V2/V0的平方随时间的变化，其中V2是液滴体积，V0是D2的初始液滴体积，其中c2>c1(即在t＝0处)。水的渗透仅通过双层发生，这具有液滴体积的平方随时间线性增加的特征。图5示出了使用液滴双层渗透率值，在非活性通道的情况下，液滴尺寸变化的一般和模拟情况。A曲线涉及具有较低浓度离子I的液滴，而B曲线涉及具有较高浓度离子I的液滴。图6A、6B和6C示出了根据本专利技术的微流体分析系统(4)的各种实施方案，其可用于以高通量方式进行根据本专利技术的方法(意指可选地)。图7示出了在使用Kv1.5通道的情况下，由于微流体设备以连续方式形成D1/D2(c1<c2)液滴对。K+离子通过活性Kv1.5通道从D2移动至D1，直到两个液滴达到等渗浓度。图8a和8b示出了液滴D1和液滴D2随时间(即在实验开始时(图8a)和在达到平衡结束时(图8b))的变化。具体实施方式如下面的实施例所示，步骤(iii)中形成的双层的两亲分子(2)(参见图1a和1b)模拟细胞膜，因此对水是可渗透的，但对于只通过特定的离子通道(3)能够从液滴流动至另一个液滴的离子是不可渗透的。离子特定于离子通道(3)(参见图3)。由于两个液滴之间的渗透压差异，在两个液滴接触后可观察到两种情形：-如果离子通道(3)是非活性的(例如由于阻滞剂的存在)以及不允许输送离子I，则离子I不能流过离子通道(3)，因此水将从具有较低浓度离子I的液滴穿过膜至具有较高浓度离子I的液滴中，以在两个液滴之间达到相同的渗透压，这将导致具有初始较低浓度离子I的液滴尺寸的减小，以及导致具有初始较高浓度离子I的液滴尺寸的增加，以及可能导致两个液滴的融合，从而在平衡时仅获得一个液滴(图2中的情况(A))；-如果离子通道(3)是活性的并允许输送离子I，则离子I也可以流过离子通道(3)，以在两个液滴之间达到相同的渗透压；可以调节双层中的离子浓度和离子通道(3)的数量，使得通过离子通道的离子转移速率高于通过膜的水转移速率，因此平衡将主要归因于离子转移使得两个液滴的尺寸不会发生显著变化(图2中的情况(B))。因此，如果在接触之前或接触时(初始状态)确定液滴的尺寸，在液滴接触之后和达到平衡状态时测量它们的尺寸或确定所产生的液滴的数量，则允许确定离子通道(3)是否是活性的。这种测量或确定可以通过简单光学检测装置(例如照相机，特别是在透射光或明场中，更具体地可以在液滴流动下以HTS方法使用的明场高速照相机)来进行。“平衡”在本专利技术中是指两个液滴的尺寸不再变化的状态。实际上，离子I和/或水通过双层膜的流动可能需要一些时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分析离子通道(3)的活性的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在疏水介质(1)中提供水溶液AS1的第一液滴D1，所述水溶液AS1包含浓度c1的离子I，其中c1≥0，其中液滴D1被单层的两亲分子(2)包围，(ii)在所述疏水介质(1)中提供水溶液AS2的第二液滴D2，所述水溶液AS2包含浓度c2的离子I，其中c2≥0且c2≠c1，其中液滴D2被单层的两亲分子(2)包围，所述单层的两亲分子(2)进一步包含待分析的离子通道(3)，(iii)将第一液滴D1和第二液滴D2接触以在接触区域中形成双层的两亲分子(2)，其中双层的两亲分子(2)进一步包含待分析的离子通道(3)，测量两个液滴在称为初始状态的接触时的半径，和(iv)保持第一液滴D1和第二液滴D2接触直至达到平衡，并测量两个接触的液滴的半径或确定在称为平衡状态的平衡时产生的液滴的数量，其中当至少一个液滴在其初始状态和其平衡状态之间的半径差为至少10％或在平衡状态下仅获得一个液滴时，离子通道(3)是非活性的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.17 EP 15306823.41.一种分析离子通道(3)的活性的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在疏水介质(1)中提供水溶液AS1的第一液滴D1，所述水溶液AS1包含浓度c1的离子I，其中c1≥0，其中液滴D1被单层的两亲分子(2)包围，(ii)在所述疏水介质(1)中提供水溶液AS2的第二液滴D2，所述水溶液AS2包含浓度c2的离子I，其中c2≥0且c2≠c1，其中液滴D2被单层的两亲分子(2)包围，所述单层的两亲分子(2)进一步包含待分析的离子通道(3)，(iii)将第一液滴D1和第二液滴D2接触以在接触区域中形成双层的两亲分子(2)，其中双层的两亲分子(2)进一步包含待分析的离子通道(3)，测量两个液滴在称为初始状态的接触时的半径，和(iv)保持第一液滴D1和第二液滴D2接触直至达到平衡，并测量两个接触的液滴的半径或确定在称为平衡状态的平衡时产生的液滴的数量，其中当至少一个液滴在其初始状态和其平衡状态之间的半径差为至少10％或在平衡状态下仅获得一个液滴时，离子通道(3)是非活性的。2.根据权利要求1所述的方法，其中，离子通道(3)是钠通道、钾通道、钙通道、质子通道或氯通道，离子I分别是Na+、K+、Ca2+、H+或Cl-。3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中，疏水介质(1)是油，例如植物油；甘油三酯；硅油；烃；或其混合物；以及优选是甘油三酯和诸如角鲨烯的烃的混合物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，两亲分子(2)是磷脂、糖脂、胆固醇或其混合物。5.根据权利要求4所述的方法，其中，两亲分子(2)是磷脂，更特别地是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)或其混合物。6.根据权利要求5所述的方法，其中，两亲分子(2)选自二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)特别是钠盐、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)特别是钠盐、及其混合物，特别地选自DOPC、DOPE及其混合物。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，第一液滴和第二液滴D1和D2的直径包含在0.5μm和1000μm之间，特别地在20μm和500μm之间，优选在50μm和200μm之间。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，浓度c1或c2为0或者浓度c1和c2满足以下等式：Ic1-c2I/(c1+c2)>0.1，特别地≥0.5，优选地≥0.99。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，较高浓度的c1和c2包含在1mM和1M之间，特别地在100mM和800mM之间，优选地在300mM和700mM之间。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，步骤(i)通过以下进行：-提供水溶液AS1，-提供疏水介质(1)，其进一步含有两亲分子(2)，和-在疏水介质(1)中形成水溶液AS1的液滴，在所述疏水介质(1)中存在两亲分子(2)。11.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·R·蒂亚姆，B·沙克，
申请(专利权)人：巴黎科学与文学联大拉丁区，巴黎大学迪德罗特第七分校，原子能和能源替代品委员会，
类型：发明
国别省市：法国,FR