一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法技术

本发明专利技术公开了一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法，其包括ELISA用微孔板，酶标抗体，缓冲液，显色液，终止液，其中微孔板上包被有SCSMV特异的多克隆抗体，酶标抗体为辣根过氧化酶标记得SCSMV特异性多克隆抗体。本发明专利技术采用的免疫原为基因工程表达的SCSMV外壳蛋白抗原。本发明专利技术还公开了一种甘蔗线条花叶病毒的检测方法。本发明专利技术在血清学水平上为甘蔗线条花叶病毒的检测提供了一种快速、灵敏、简便的方法，并且经济实用，也为甘蔗生产中甘蔗线条花叶病毒的防治及其脱毒苗的制备提供了有效方法。

Double antibody sandwich ELISA kit for sugarcane line mosaic virus and preparation and detection method thereof

The invention discloses a sugarcane streak mosaic virus double antibody sandwich enzyme-linked immunoassay kit and its preparation and detection method, which comprises a microporous plate for ELISA, an enzyme-labeled antibody, a buffer, a color developing solution and a terminating solution. The microporous plate is coated with SCSMV-specific polyclonal antibody, and the enzyme-labeled antibody is labeled with horseradish peroxidase to obtain S. CSMV specific polyclonal antibody. The immunogen is genetically engineered to express the SCSMV coat protein antigen. The invention also discloses a detection method for sugarcane line mosaic virus. The invention provides a fast, sensitive and simple method for the detection of sugarcane streak mosaic virus at the serological level, and is economical and practical. It also provides an effective method for the prevention and control of sugarcane streak mosaic virus in sugarcane production and the preparation of virus-free seedlings.

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法
本专利技术涉及植物病毒检测的生物技术产品领域，具体涉及一种可用于对甘蔗线条花叶病毒进行快速检测的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒(DAS-ELISA)，本专利技术还涉及该试剂盒的制备方法及检测方法。
技术介绍
甘蔗花叶病(Sugarcanemosaicdisease，SMD)是一类广泛发生在世界各大甘蔗产区的重要的甘蔗病害，主要症状表现为叶片呈黄绿相间、不规则的嵌纹、条斑或斑驳状，叶色较浅，生长势差、植株矮化，一般可引起10-40％的产量损失，糖份下降，该病害在云南、广西两省区甘蔗栽培区和国家甘蔗种质资源圃内广泛发生，严重的制约了两省区蔗糖产业的持续稳定发展。甘蔗花叶病病原复杂，可由多种病毒引起。目前为止，已明确鉴定出的病害病原有甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)等3种病毒。SCSMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)禾本科病毒属(Poacevirus)。该病毒基因组约为10kb，编码一个多聚蛋白，经蛋白酶水解切割后可产生10个成熟的蛋白质，在P3蛋白氨基端有一个PIPO蛋白。SCSMV首先在甘蔗花叶病株上发现，自然条件下能够侵染甘蔗、高粱和一些禾本科杂草。2008-2012年，我们在云南省甘蔗产区首次发现SCSMV，后续调查发现，SCSMV云南省甘蔗主产区发生越来越普遍，部分地区呈现流行爆发趋势。因此，发展SCSMV的快速检测鉴定技术迫在眉睫，目前，SCSMV主要通过电镜技术、分子生物学技术进行检测，由于目前尚无SCSMV特异性抗血清，无法利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本
技术实现思路
提供一种用于甘蔗线条花叶病毒检测的准确高效、易于推广、经济实用的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，以及该试剂盒的制备方法及检测方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SCSMV特异性多克隆抗体，SCSMV特异性多克隆抗体包被于多克隆抗体包被板上。所述SCSMV特异性多克隆抗体的氨基酸序列为：GTQPPQNQSSSPATTSSISSTTTSQVGSQTTGNLSNTVSQTMKSLYVPPLVKSLKTEAKAKQMMRYTPPQALISSSAASIRQFNDWANTAAEGYGKTIQQFTDEILPFWIYWCVVNGATEENKTKPKWTKAVLNLDGADGTEITVDENGPQVEFEMGPMYRNAKPGIRAIMRHFGELAYKWVRFSVRSGKPIIPHNAVKAGLTTPEFYPCCIDFVMVNILSPAEIDVRNQVINARTPRMGKPLFRHALRAGGDEDTDLRREDDANYGRTQIGGAHFGRAQH(SEQIDNo.3)。所述试剂盒还包括辣根过氧化酶标记多克隆抗体、基因工程重组SCSMV外壳蛋白标准品、质控品。还包括辅助试剂：提取反应液、洗涤缓冲液、酶缓冲液、显色剂及反应终止液。前述检测试剂盒的制备方法，包括基因工程重组SCSMV外壳蛋白标准品的制备步骤、特异多克隆抗体的制备步骤、SCSMV多克隆抗体包被板的制备步骤、辣根过氧化酶标多克隆抗体的制备步骤、质控品的制备以及辅助试剂的制备步骤。所述SCSMV外壳蛋白标准品的制备步骤中，以感染SCSMV的甘蔗叶片的总RNA为模版，使用引物：SEQIDNo、1的SCSMCPF和SEQIDNo、2的SCSMCPR扩增获得SCSMV的CP基因，克隆入pET-28a载体得到重组质粒pET28a-SCSMCP，经原核表达纯化获得31kDa的外壳蛋白。所述多克隆抗体包被板，用纯化的SCSMV外壳蛋白免疫动物获得的SCSMV多克隆抗体包被酶标板制作而成。所述辣根过氧化物酶标多克隆抗体，用纯化的SCSMV外壳蛋白免疫动物获得的SCSMV多克隆抗体标记辣根过氧化物酶制作而成。一种甘蔗线条花叶病毒的检测方法，使前述的试剂盒对甘蔗线条花叶病毒进行检测。具体地，一种甘蔗线条花叶病毒检测的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括包被有SCSMV特异性多克隆抗体的96微孔板(即多克隆抗体包被板)、辣根过氧化酶标记多克隆抗体、基因工程重组SCSMV外壳蛋白标准品、质控品以及底物反应液、洗涤缓冲液、酶缓冲液、显色剂及反应终止液等辅助试剂。本专利技术中，甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白标准品的制备，以感染SCSMV的甘蔗叶片的总RNA为模版，使用引物SCSMCPF和SCSMCPR扩增获得SCSMV的CP基因，经酶切连接，克隆入pET-28a载体得到重组质粒pET28a-SCSMCP，将该重组质粒转化至大肠杆菌Rossta菌株，37℃培养过夜，IPTG诱导表达，而后经镍柱亲和层析纯化得到大小为31kDa的外壳蛋白。所述外壳蛋白SCSMCP的引物设计为：SCSMCPF：5’-GGGCCATGGGAACGCAGCCACCCCAG-3’；酶切位点NcoISCSMCPR：5’-GGGGAGCTCTGCTGAGCGCGCCCAAAAT-3’；酶切位点SacI本专利技术中的多克隆抗体包被板，可用原核表达纯化的SCSMV外壳蛋白(即甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白标准品的制备步骤得到的外壳蛋白)免疫新西兰大白兔获得的多克隆抗体包被酶标板制作。该试剂盒采用的酶标板为一种进口96孔酶标板。制备步骤如下：(1)选择体重2.5Kg左右青壮年新西兰大白兔，做好标记。用浓度为1mg/mLSCSMV外壳蛋白作为免疫原新西兰大白兔。首次免疫中，先将抗原完全混匀，而后与弗氏完全佐剂按照1:1体积比充分混匀，乳化完全后，进行多点皮下注射，每点0.2mL。第二-四次免疫采用弗氏不完全佐剂，仍按照1:1体积比与抗原充分混匀。首免后第14天进行二免，二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。采血后，加入质量百分比浓度为0.02％的叠氮化钠，-20℃保存。所得抗血清通过DE52阴离子交换柱层析法纯化。(2)将纯化的兔抗多克隆抗体用pH9.6、50mM磷酸盐缓冲液稀释为终浓度1μg/mL，而后加入酶标板各个孔中，每孔100μL，37℃孵育2h。用洗涤缓冲液冲洗酶标板，而后用封闭液封闭。封闭液为含有2％明胶，0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。封闭后，经甩干晾干，即得到多克隆抗体包被板。本专利技术提供了辣根过氧化物酶标多克隆抗体的制备方法。将辣根过氧化物酶与纯化的SCSMV外壳蛋白免疫新西兰大白兔获得的多克隆抗体按照1:1摩尔分子比标记。制备步骤如下：(1)将辣根过氧化物酶溶于蒸馏水，加入新配制的NaIO4水溶液，混匀后，4℃避光静置30min；(2)加入0.5mL乙二醇水溶液，25℃避光静置30min；(3)加入含纯化抗体的水溶液(与辣根过氧化物酶等摩尔比)，混匀后装入透析袋，经0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液透析6h；(4)加入NaBH4水溶液，混匀后，4℃避光静置2h；(5)在上述溶液中，缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SCSMV特异性多克隆抗体，SCSMV特异性多克隆抗体包被于多克隆抗体包被板上。

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SCSMV特异性多克隆抗体，SCSMV特异性多克隆抗体包被于多克隆抗体包被板上。2.根据权利要求1所述的一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述SCSMV特异性多克隆抗体的氨基酸序列为：GTQPPQNQSSSPATTSSISSTTTSQVGSQTTGNLSNTVSQTMKSLYVPPLVKSLKTEAKAKQMMRYTPPQALISSSAASIRQFNDWANTAAEGYGKTIQQFTDEILPFWIYWCVVNGATEENKTKPKWTKAVLNLDGADGTEITVDENGPQVEFEMGPMYRNAKPGIRAIMRHFGELAYKWVRFSVRSGKPIIPHNAVKAGLTTPEFYPCCIDFVMVNILSPAEIDVRNQVINARTPRMGKPLFRHALRAGGDEDTDLRREDDANYGRTQIGGAHFGRAQH。3.根据权利要求1所述的一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括辣根过氧化酶标记多克隆抗体、基因工程重组SCSMV外壳蛋白标准品、质控品。4.根据权利要求1或3所述的一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括辅助...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺振，陈春峰，陈雯，甘海峰，张坤，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32