负载治疗性蛋白质的纳米粒及其制备方法技术

本发明专利技术属于纳米医药技术领域，涉及一种制备负载治疗性蛋白质的纳米粒的方法，以及一种负载治疗性蛋白质的纳米粒，含有所述纳米粒的混悬液和药物组合物，含有所述纳米粒、混悬液或药物组合物的药物制剂。本发明专利技术还涉及所述纳米粒用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防或治疗所述纳米粒中包含的治疗性蛋白质所能够预防或治疗的疾病。

Nanoparticles loaded with therapeutic proteins and their preparation methods

The invention belongs to the field of nanomedicine technology, and relates to a method for preparing nanoparticles loaded with therapeutic proteins, and a nanoparticles loaded with therapeutic proteins, suspensions containing the nanoparticles and pharmaceutical compositions, and pharmaceutical preparations containing the nanoparticles, suspensions or pharmaceutical compositions. The invention also relates to the use of the nanoparticles for the preparation of pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of diseases that therapeutic proteins contained in the nanoparticles can prevent or treat.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】负载治疗性蛋白质的纳米粒及其制备方法
本专利技术属于纳米医药
，涉及一种制备负载治疗性蛋白质的纳米粒的方法，以及一种负载治疗性蛋白质的纳米粒，含有所述纳米粒的混悬液和药物组合物，以及含有所述纳米粒、混悬液或药物组合物的药物制剂。本专利技术还涉及所述纳米粒用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防或治疗所述纳米粒中包含的治疗性蛋白质所能够预防或治疗的疾病。
技术介绍
糖尿病是位于心血管疾病和癌症之后威胁人类健康的一大疾病。美国糖尿病协会1998年年度报告中指出，目前世界范围内，糖尿病患者约为1.35亿人，到2025年，估计糖尿病患者将上升到3亿人，其中发达国家将由5100万增加到7200万，增加42％；而发展中国家将由8400万跃进到2.28亿人，增幅达170％。在发达国家中，美国的糖尿病患者接近1600万，约占美国总人口的5.9％，美国每年在预防和治疗糖尿病上约花费1000亿美元左右。我国的糖尿病患病状况也不容乐观。1998年的统计表明，我国有2000多万糖尿病患者，25岁至64岁的人群中发病率为2.5％。随着我国人口的日益老龄化以及现代人生活方式的改变，预防和治疗糖尿病已经引起了广泛的关注。目前，胰岛素(Insulin)是治疗糖尿病的最有效的药物之一，但大多采用皮下注射给药。长期注射胰岛素有很多缺点，例如：病人产生痛苦及恐惧；注射方式不方便；局部血内胰岛素含量过多，刺激平滑肌细胞增殖，使葡萄糖转化成动脉壁的脂质物质；在胰岛素注射部位，由于胰岛素局部沉淀导致局部肥大以及脂肪沉淀；对胰岛素依赖；费用高昂；注射过程易导致感染等。口服胰岛素是最符合胰岛素生理分泌方式的给药途径，胰岛素直接由肠入肝，可避免周边高浓度胰岛素效应的产生，且对维持正常的胰岛素敏感性很有意义。然而，胰岛素通过口服途径给药时有以下亟待解决的问题：首先，由于胃中的酸性环境，胰岛素在胃中很容易被降解；第二，胰岛素在消化道内可被酶降解失活；最后，由于胰岛素的高分子量和低脂溶性，其在肠粘膜上皮细胞的渗透性低，导致其较低的口服生物利用度。近年来，纳米载体在改善胰岛素的口服输送方面被认为具有广阔的前景。壳聚糖(CS)由甲壳素经过脱乙酰化产生，是一个具有良好理化性质并被广泛使用的天然多糖。它具有无毒、生物可降解性和生物相容性的特征。壳聚糖分子中的大量活性氨基在酸性介质中可以质子化，形成聚阳离子电解质，因此，利用聚阴离子交联带正电荷的壳聚糖，可以制备负载胰岛素的纳米粒。现有技术中，使用壳聚糖制备负载胰岛素的纳米粒的方法包括逐步滴加法和快速倾倒法。现有方法制备的纳米粒通常粒径较大，且粒径分布不均，在制备过程的可控性、稳定性及重复性方面并不理想。因此，本领域需要新的制备负载胰岛素的纳米粒的方法。
技术实现思路
在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中使用的，术语“治疗性蛋白质”是指能够用于或预防或治疗疾病的蛋白质。如本文中使用的，术语“纳米粒”是指尺寸(即颗粒的最长维度中的直径)在纳米级的颗粒，例如尺寸不大于1,000nm、不大于500nm、不大于200nm或不大于100nm的颗粒。如本文中使用的，术语“颗粒”是指以离散颗粒、丸粒、珠粒或团粒存在为特征的物质状态，而不管其大小、形状或形态如何。如本文中使用的，术语“粒径”即“等效粒径”，是指当被测颗粒的某种物理特性或物理行为与某一直径的同质球体(或组合)最相近时，就把该球体的直径(或组合)作为被测颗粒的等效粒径(或粒度分布)。如本文中使用的，术语“平均粒径”是指对于一个由大小和形状不相同的粒子组成的实际粒子群，与一个由均一的球形粒子组成的假想粒子群相比，如果两者的粒径全长相同，则称此球形粒子的直径为实际粒子群的平均粒径。平均粒径的测量方法是本领域技术人员已知的，例如光散射法；平均粒径的测量仪器包括但不限于马尔文粒径仪。如本文中使用的，术语“室温”是指25±5℃。如本文中使用的，术语“约”应该被本领域技术人员理解，并将随其所用之处的上下文而有一定程度的变化。如果根据术语应用的上下文，对于本领域技术人员而言，其使用不是清楚的，那么“约”的意思是不超过所述特定数值或范围的正负10％。如本文中使用的，术语“预防”是指阻止或延迟疾病的发生。如本文中使用的，术语“治疗”是指治愈或至少部分阻止疾病，或缓解疾病的症状。本专利技术人通过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种制备负载治疗性蛋白质的纳米粒的方法，本专利技术的方法过程简单、条件温和、重复性好，相比于现有负载治疗性蛋白质的纳米粒，本专利技术的方法制得的纳米粒的粒径较小、粒径分布较窄、蛋白质的包封率高，由此提供了下述专利技术：在一个方面，本申请涉及一种制备负载治疗性蛋白质的纳米粒的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：提供壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水；步骤2：使壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水分别通过第一通道、第二通道、第三通道和第四通道到达涡流混合区域中，进行混合；其中，壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水在通道中以相同的流速匀速流动；并且，壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水的流速为1-120mL/min(例如1-15mL/min、15-25mL/min、25-50mL/min、1-50mL/min、50-100mL/min或100-120mL/min)。在一个优选的实施方案中，所述方法在包含第一通道、第二通道、第三通道、第四通和涡流混合区域的装置中进行。在一个优选的实施方案中，所述装置为多入口涡流混合器。在一个优选的实施方案中，所述治疗性蛋白质为胰岛素。在一个优选的实施方案中，所述聚阴离子选自三聚磷酸钠、海藻酸、肝素、透明质酸、硫酸软骨素、聚丙烯酸类聚合物、聚苯乙烯磺酸类聚合物；更优选地，所述聚阴离子为三聚磷酸钠。在一个优选的实施方案中，所述步骤1中，壳聚糖溶液、治疗性蛋白质溶液和聚阴离子溶液的浓度比(mg/mL：mg/mL：mg/mL)为1:0.1-0.7:0.2-0.5，例如1:0.1-0.3:0.2-0.5、1:0.3-0.5:0.3-0.5或1：0.35-0.70：0.2-0.35，例如1：0.35-0.50：0.3-0.35、1：0.35-0.70：0.25-0.35、1：0.55-0.70：0.2-0.35或1：0.35-0.70：0.25-0.35。本专利技术所述的壳聚糖溶液的浓度，是指壳聚糖溶液所含壳聚糖的质量浓度；本专利技术所述的治疗性蛋白质溶液的浓度，是指治疗性蛋白质溶液所含治疗性蛋白质的质量浓度；本专利技术所述的聚阴离子溶液的浓度，是指聚阴离子溶液所含聚阴离子的质量浓度。在一个优选的实施方案中，所述步骤1中，治疗性蛋白质溶液的浓度为0.1-0.7mg/mL，例如0.1-0.2mg/mL、0.2-0.3mg/mL、0.3-0.4mg/mL、0.4-0.5mg/mL、0.5-0.6mg/mL、0.6-0.7mg/mL或0.35-0.7mg/mL，例如0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备负载治疗性蛋白质的纳米粒的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：提供壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水；步骤2：使壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水分别通过第一通道、第二通道、第三通道和第四通道到达涡流混合区域中，进行混合；其中，壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水在通道中都以匀速流动；壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水的流速相同；并且，壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水的流速为1‑120mL/min(例如1‑15mL/min、15‑25mL/min、25‑50mL/min、1‑50mL/min、50‑100mL/min或100‑120mL/min)；优选地，所述治疗性蛋白质为胰岛素；优选地，所述聚阴离子选自三聚磷酸钠、海藻酸、肝素、透明质酸、硫酸软骨素、聚丙烯酸类聚合物、聚苯乙烯磺酸类聚合物；更优选地，所述聚阴离子为三聚磷酸钠；优选地，所述步骤1中，壳聚糖溶液、治疗性蛋白质溶液和聚阴离子溶液的浓度比(mg/mL：mg/mL：mg/mL)为1:0.1‑0.7:0.2‑0.5。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备负载治疗性蛋白质的纳米粒的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：提供壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水；步骤2：使壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水分别通过第一通道、第二通道、第三通道和第四通道到达涡流混合区域中，进行混合；其中，壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水在通道中都以匀速流动；壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水的流速相同；并且，壳聚糖溶液、聚阴离子溶液、治疗性蛋白质溶液和水的流速为1-120mL/min(例如1-15mL/min、15-25mL/min、25-50mL/min、1-50mL/min、50-100mL/min或100-120mL/min)；优选地，所述治疗性蛋白质为胰岛素；优选地，所述聚阴离子选自三聚磷酸钠、海藻酸、肝素、透明质酸、硫酸软骨素、聚丙烯酸类聚合物、聚苯乙烯磺酸类聚合物；更优选地，所述聚阴离子为三聚磷酸钠；优选地，所述步骤1中，壳聚糖溶液、治疗性蛋白质溶液和聚阴离子溶液的浓度比(mg/mL：mg/mL：mg/mL)为1:0.1-0.7:0.2-0.5。2.权利要求1的方法，所述步骤1的治疗性蛋白质溶液的浓度为0.1-0.7mg/mL；优选地，所述步骤1的治疗性蛋白质溶液的pH为1.5-3.5；优选地，所述步骤1的治疗性蛋白质溶液中还含有盐酸；优选地，所述步骤1的治疗性蛋白质溶液通过包含以下步骤的方法制得：将治疗性蛋白质溶解于pH为1.5-3.5的盐酸溶液。3.权利要求1或2的方法，所述步骤1的壳聚糖溶液中，壳聚糖的数均分子量为10-500KDa(例如10-50KDa、50-90KDa、90-150KDa、150-190KDa、190-250KDa、250-350KDa或350-500KDa)；优选地，所述步骤1的壳聚糖溶液的pH为5.0-6.0；优选地，所述步骤1的壳聚糖溶液通过包含以下步骤的方法制得：将壳聚糖溶解于0.1％-1％的醋酸溶液，并用碱(例如，氢氧化钠)将醋酸溶液的pH调节为5.0-6.0。4.权利要求1-3任一项的方法，所述步骤1中，聚阴离子溶液的浓度为0.2-0.5mg/mL；优选地，所述步骤1的聚阴离子溶液还含有缓冲试剂，例如4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)；优选地，所述步骤1的聚阴离子溶液的pH为6.0-9.0；优选地，所述步骤1的聚阴离子溶液通过包含以下步骤的方法制得：将聚阴离子溶解于HEPES缓冲溶液中；更优选地，还包括用碱性物质(例如氢氧化钠)进一步调节溶液的pH。5.权利要求1-4任一项的方法，所述方法的步骤2得到混悬液，所述混悬液包含负载治疗性蛋白质的纳米粒；优选地，步骤2得到的混悬液的pH为5.5-6.5(例如5.5-5.8、5.8-6.0、6.0-6.2或6.2-6.5)；优选地，所述方法还包括步骤3：对混悬液进行冷冻干燥；优选地，所述方法还包括：在步骤3之前，向混悬液中加入冻干保护剂；优选地，所述冻干保护剂选自甘露醇和木糖醇；优选地，所述冻干保护剂为甘露醇和木糖醇的组合；优选地，甘露醇的质量、木糖醇的质量与混悬液的体积之比为0.2-0.5g:0.5-1.5g:100mL。6.权利要求1-5任一项的方法，所述步骤2在多入口涡流混合器中进行，例如在四入口涡流混合器中进行；优选地，所述多入口涡流混合器包括位于上部的第一部件、位于中部的第二部件和位于下部的第三部件，所述第一部件、第二部件和第三部件为具有相同直径的圆柱体；第一部件设置有多个通道，第二部件设置涡流混合区域和多个导流区域，第三部件设置通道；第一部件的通道与第二部件的导流区域流体连通；第二部件的导流区域均与涡流混合区域流体连通；第二部件的涡流混合区域与第三部件的通道流体连通；优选地，使用螺纹连接装置将第一部件、第二部件和第三部件密封连接；优选地，所述多入口涡流混合器由刚性材料(例如不锈钢)制成。7.一种负载治疗性蛋白质的纳米粒，其包含治疗性蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：何治宇，陈永明，黄华华，刘利新，乔斯·路易斯·德修尔桑托斯，毛海泉，梁锦荣，
申请(专利权)人：中山大学，约翰·霍普金斯大学，
类型：发明
国别省市：广东,44