一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明专利技术通过将淀粉分支酶中的氨基酸残基突变为与内源性氨基酸残基带相反电荷的氨基酸残基，与附近内源性、带相反电荷的氨基酸残基形成静电相互作用，得到热稳定提高的淀粉分支酶突变体，与野生型淀粉分支酶相比，本发明专利技术所得的淀粉分支酶突变体Q231R、Q231K、T339E、T339D、V37E、V37D和I571D的热稳定性在60C下的半衰期t1/2(min,60℃)分别延长40％、38％、21％、26％、16％和21％，在65C下的半衰期t1/2(min,65℃)分别延长1.5‑2.0倍。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体
本专利技术涉及一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体，属于酶工程

技术介绍
淀粉分支酶(1,4-α-glucanbranchingenzyme；EC2.4.1.18)是属于糖苷水解酶家族13(GH13)的一类糖基转移酶，能够催化淀粉分子α-1,4-糖苷键的断裂形成游离短链，并通过转糖苷作用将切割下的短链以α-1,6-糖苷键的形式连接于受体链上，在淀粉分子原主链上形成新的α-1,6-分支点。通过该种转糖基反应，淀粉分支酶能够增加淀粉的分支度，提高淀粉的抗消化性和慢消化性，延缓淀粉的回生过程，增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能，可用于生产具有良好应用价值的淀粉衍生物。在淀粉的改性过程中，淀粉分支酶的热稳定性是一个关键因素，淀粉分支酶的热稳定性强不仅有利于延长酶的贮藏时间、减少酶在保存、运输过程中活力的损失，而且可以使酶在较高的温度下保持较高的活力，从而提高反应效率，缩短生产周期，进而降低生产成本。目前，已被报道的用来提高淀粉分支酶热稳定性的方法有物理法、化学法、生物法等。在这些方法中，物理法存在产量低和稳定性差等问题，化学法在食品领域中的应用受到一定限制。相比于物理法和化学法，生物法主要通过蛋白质工程、基因工程等技术手段，从根本上改变酶蛋白分子的空间构象，改善酶蛋白的使用性能，具有环境危害小、可良性遗传等优点，成为了改善酶蛋白分子热稳定性的重要技术手段。
技术实现思路
本专利技术的技术目的是通过将淀粉分支酶突变体为将淀粉分支酶中的氨基酸残基突变为与该氨基酸残基附近的内源性氨基酸残基带相反电荷的氨基酸残基的淀粉分支酶突变体内源性氨基酸残基带相反电荷的氨基酸残基，与附近内源性、带相反电荷的氨基酸残基形成静电相互作用，得到热稳定性提高的淀粉分支酶突变体。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体，所述淀粉分支酶突变体是通过将淀粉分支酶中的氨基酸残基突变为与该氨基酸残基附近的内源性氨基酸残基带相反电荷的氨基酸残基得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体的突变位点为第231位、第339位、第37位或第571位。在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体是将淀粉分支酶第231位的谷氨酰胺突变为精氨酸或赖氨酸，或将淀粉分支酶第339位的苏氨酸突变为谷氨酸或天冬氨酸，或将淀粉分支酶第37位的缬氨酸突变为谷氨酸或天冬氨酸，或将淀粉分支酶第571位的异亮氨酸突变为天冬氨酸的淀粉分支酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉分支酶为来源于GeobacillusthermoglucosidansSTB02的淀粉分支酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉分支酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1。在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体的氨基酸序列分别为SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7或SEQIDNO.8。本专利技术提供了上述热稳定性提高的淀粉分支酶突变体在水解淀粉方面的应用。本专利技术提供了编码上述热稳定性提高的淀粉分支酶突变体的基因。本专利技术提供了携带上述基因的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-20b(+)为表达载体，以EscherichiacoliBL21(DE3)为表达宿主。本专利技术提供了上述基因工程菌在水解淀粉方面的应用。有益效果：与野生型淀粉分支酶相比，本专利技术所得的淀粉分支酶突变体Q231R、Q231K、T339E、T339D、V37E、V37D和I571D的热稳定性在60℃下的半衰期t1/2(min,60℃)分别延长40％、38％、21％、26％、16％和21％，在65℃下的半衰期t1/2(min,65℃)分别延长1.5-2.0倍。附图说明图1为本专利技术实施例中各淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶的热失活速率曲线；图2为本专利技术实施例中各淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶的热失活速率曲线；图3为本专利技术实施例中各淀粉分支酶突变体及野生型淀粉分支酶的热失活速率曲线。具体实施方式本专利技术的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。本专利技术涉及的检测方法如下：淀粉分支酶热稳定性的分析方法：将淀粉分支酶在一定温度下保温，不同时间点取样，迅速冷却至0℃，测定酶的残余活力，以未保温酶液的活力为100％。绘制相对酶活-时间曲线。淀粉分支酶活力的测定方法：用10mM磷酸缓冲液(pH7.5)配制0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液，加入0.01g/mL淀粉分支酶后混合均匀并置于50℃水浴条件下反应15min。反应结束后沸水浴灭酶。取175L反应混合液加入2.5mL显色液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I2，pH7.5)置于室温下静置15min以充分显色。显色15min后在530nm处测定吸光值。一个酶活力单位定义为：在530nm处，吸光值每分钟降低1％所需加入酶的量为一个酶活力单位。本专利技术所用的培养基如下：LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH7.0。TB培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，KH2PO417mM，K2HPO472mM，pH7.0。实施例1：表达本专利技术淀粉分支酶突变体基因序列的制备以表达载体gbe/pET-20(+)为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照TaKaRa公司STARPrimerGXL试剂盒说明书所示方法进行定点突变。PCR反应体系依照STARPrimer试剂盒说明书中所设定条件：5×PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)10μL，模板DNA1μL，正向和反向引物(10μM)均为1μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，最后加入超纯水32.5μL。PCR扩增条件为：98℃条件下预变性5min；随后以98℃10s，55℃10s，72℃7min为一个循环，在以上条件下进行35个循环；最后72℃下保温15min。表1淀粉分支酶突变位点的引入引物引物序列(5'-3')1Q231R-ForSEQIDNO.9：ATCGCTTCCATCGAGCGGGCATTGGQ231R-RevSEQIDNO.10：CCAATGCCCGCTCGATGGAAGCGATQ231K-ForSEQIDNO.11：ATCGCTTCCATAAAGCGGGCATTGGQ231K-RevSEQIDNO.12：CCAATGCCCGCTTTATGGAAGCGATQ231A-ForSEQIDNO.13：ATCGCTTCCATGCAGCGGGCATTGGQ231A-RevSEQIDNO.14：CCAATGCCCGCTGCATGGAAGCGATT339E-ForSEQIDNO.15：ATTAAATGAGGAGGTATTTGCGCT339E-RevSEQIDNO.16：GCGCAAATACCTCCTCATTTAATT339D-ForSEQIDNO.17：ATTAAATGAGGACGTATTTGCGCT339D-RevSEQIDNO.18：GCGCAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述淀粉分支酶突变体是通过将淀粉分支酶中的氨基酸残基突变为与该氨基酸残基附近的内源性氨基酸残基带相反电荷的氨基酸残基得到的。

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述淀粉分支酶突变体是通过将淀粉分支酶中的氨基酸残基突变为与该氨基酸残基附近的内源性氨基酸残基带相反电荷的氨基酸残基得到的。2.如权利要求1所述的一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述淀粉分支酶突变体的突变位点为第231位、第339位、第37位或第571位。3.如权利要求1或2所述的一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述淀粉分支酶突变体是将淀粉分支酶第231位的谷氨酰胺突变为精氨酸或赖氨酸，或将淀粉分支酶第339位的苏氨酸突变为谷氨酸或天冬氨酸，或将淀粉分支酶第37位的缬氨酸突变为谷氨酸或天冬氨酸，或将淀粉分支酶第571位的异亮氨酸突变为天冬氨酸的淀粉分支酶突变体。4.如权利要求1-3任一所述的一种热稳定性提高的淀粉分支酶突变体，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆丰，班宵逢，顾正彪，李才明，程力，洪雁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32