一种DBAT突变酶R363H及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种DBAT突变酶R363H及其应用。所述的突变酶是氨基酸序列为SEQ ID NO：2的DBAT酶的第363位氨基酸由Arg改变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO：14。本发明专利技术成功构建出突变酶R363H。该突变酶在利用乙酰辅酶A的催化效率上比野生型酶提高了12倍，大大提高了乙酰辅酶A的使用率和产物巴卡亭Ⅲ的产量。同时，为降低生产成本，本发明专利技术寻找了7种新型酰基供体，突变酶均能高效利用这些酰基供体，其中对乙酸乙烯酯的利用率提高了100倍，能作为替代昂贵的乙酰辅酶A用于制备巴卡亭Ⅲ。迄今为止，在生物合成巴卡亭Ⅲ的研究中，并未发现有以非植物辅酶类为酰基供体并体现高利用率的研究。

DBAT mutant enzyme R363H and its application

The invention discloses a DBAT mutant enzyme R363H and its application. The mutant enzyme is a DBAT enzyme whose amino acid sequence is SEQ ID NO:2 and whose amino acid sequence is SEQ ID NO:14. The mutant R363H is successfully constructed. The catalytic efficiency of the mutant enzyme was 12 times higher than that of the wild type enzyme, and the utilization rate of acetyl coenzyme A and the yield of the product Bakatine III were greatly increased. At the same time, in order to reduce the production cost, the invention has searched for seven new acyl donors. The mutant enzymes can efficiently utilize these acyl donors, and the utilization rate of vinyl acetate has been increased 100 times, which can be used as an alternative to expensive acetyl coenzyme A to prepare baccatin III. Up to now, no studies on the high utilization of non-plant coenzymes as acyl donors have been found in the biosynthesis of baccatin III.

【技术实现步骤摘要】
一种DBAT突变酶R363H及其应用
本专利技术属于生物分子催化领域，特别涉及一种DBAT酶(10-去乙酰基巴卡亭III-10β乙酰基转移酶)突变酶R363H及其应用。
技术介绍
定制酶一直是生物化学家奋斗的目标。随着分子生物学技术的逐渐成熟，对蛋白序列进行任意修改，可以解读酶的催化机理并继续理性设计酶。这种理性设计可以是增加已有酶的性质，甚至是重新设计一个蛋白质。高催化活性酶是在生物产业中发挥重要潜能的关键所在，也是现代蛋白质工程研究的主攻方向。新型催化剂的理性设计往往会拓展我们对蛋白生化特性的认识，尤其是那些错误少、时间使用合理的蛋白质理性改造过程。目前已利用理性设计突变位点技术对天然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特异性、热稳定性以及改进酶的别构效应等进行了成功的改造(Kriesetal.,2013)。然而，理性设计方法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。目前理性设计的思路仍然主要是由Hellinga和Richards于1991年提出的给蛋白增加新的结合位点的观点。实际操作中，第一步在蛋白分子内引入新的功能域，第二步再进行优化(Feldmeieretal.,2013；Kogaetal.,2012)。酶活性中心是酶催化的核心部位，其特定的构象不仅有助于底物结合，还能促进高效的催化作用。因此对酶活性位点改造相较整体蛋白质的改造能更为直接，更为显著的提升酶的催化活性(Kissetal.,2013)。但是，酶的活性中心需要十分精确的构象调节，它既需要一定的柔性去识别底物，完成催化反应，又需要一定的刚性维持合理的构象，来保持良好的生物学活性；酶的活性中心保持着柔性与刚性间的微妙平衡，随意对活性中心的突变，会导致酶的迅速失稳或者失活(Hilvert,2013)。随着学者们对酶结构与功能关系认知的逐步完善，计算生物学的迅猛发展，利用计算机辅助设计进化酶学性质的方法也日趋成熟。利用计算机模拟的方法，可以快速鉴定与催化直接相关的不可突变的氨基酸和有可能提升酶活性的靶标位点，为蛋白质工程改造提供快速的指导。本专利技术通过合成生物学的手段，研究10-去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰基转移酶的底物拓展和理性设计新酶，建立合成巴卡亭Ⅲ的新方法。本专利技术能通过高效制备巴卡亭Ⅲ从而极大的改善紫杉醇供不应求的现状。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的首要在于提供一种DBAT突变酶R363H。该DBAT突变酶R363H比野生型DBAT酶具有更高的催化效率。本专利技术的另一目的在于提供上述DBAT突变酶R363H的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种DBAT突变酶R363H，是氨基酸序列为SEQIDNO：2的DBAT酶的第363位氨基酸由精氨酸(Arg)变为组氨酸(His)。上述DBAT突变酶R363H的氨基酸序列为SEQIDNO：14，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO：13。本专利技术另一方面涉及携带具有编码序列为SEQIDNO：13的DBAT突变酶R363H基因的重组质粒，所述的重组质粒为pET-R363H。本专利技术还涉及一种工程菌株，其携带上述重组质粒。所述的工程菌株为重组表达菌株TBL21-R363H，即重组质粒转化进宿主大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21所得。所述的DBAT突变酶R363H在催化10-DAB合成巴卡亭Ⅲ中的应用。以乙酰辅酶A为酰基供体时，该DBAT突变酶R363H比DBAT酶的催化效率提高了12倍。以酰基供体1、酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4、酰基供体5、酰基供体6或酰基供体7为酰基供体时，所述的DBAT突变酶R363H比DBAT酶具有更高的催化效率。所述的酰基供体1为乙酸乙烯酯；所述的酰基供体2为乙酸丁酯；所述的酰基供体3为乙酸异丁酯；所述的酰基供体4为乙酸仲丁酯；所述的酰基供体5为乙酸戊酯；所述的酰基供体6为乙酸异戊酯；所述的酰基供体7为乙酸异丙烯酯。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：本专利技术运用同源建模，分子对接的计算机辅助技术，对DBAT酶进行理性设计，成功构建出突变酶R363H。该突变酶在利用乙酰辅酶A的催化效率上比野生型酶提高了12倍，大大提高了乙酰辅酶A的使用率和产物巴卡亭Ⅲ的产量。同时，为降低生产成本，本专利技术寻找了7种新型酰基供体，突变酶均能高效利用这些酰基供体，其中对乙酸乙烯酯的利用率提高了100倍，能作为替代乙酰辅酶A成为合成底物用于制备巴卡亭Ⅲ。迄今为止，在生物合成巴卡亭Ⅲ的研究中，并未发现有以非植物辅酶类为酰基供体并体现高利用率的研究。附图说明图1是各突变酶的SDS-PAGE结果。图2是各突变酶纯化后的SDS-PAGE结果。图3是突变酶D166H催化不同浓度酰基供体1、5、7产生巴卡亭Ⅲ的结果。图4是突变酶R363H催化不同浓度酰基供体1、7产生巴卡亭Ⅲ的结果。图5是突变酶D166HR363H(简称DHRH)催化不同浓度酰基供体1、6、7产生巴卡亭Ⅲ的结果。图6是DHRH、R363H和D166H分别相对野生型DBAT在利用酰基供体1、2、3、4、5、6上的效率对比图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例1野生型DBAT的获得在NCBI上公布的DBAT酶的基因序列SEQIDNO：1(GenBank：JQ029678.1)，在其起始密码子ATG前增加GGAATTC(EcoRⅠ酶切位点)，在其终止密码子TGA后增加GCGGCCGCTTTA(NotⅠ酶切位点)，获得带有酶切位点的DBAT酶的基因序列。用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ(Invitrogen公司)对DBAT酶的基因进行双酶切；同时，用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对pET-32a(+)载体(Invitrogen公司)进行双酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Invitrogen公司)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞(Invitrogen公司)中，质粒小量提取，酶切鉴定，PCR(引物是dbat-F和dbat-R)鉴定后送测序确定表达载体构建成功，命名为pET-DBAT。重组质粒转化E.coliBL21(Invitrogen公司)，获得重组表达菌株TBL21-DBAT。所述DBAT的氨基酸序列为SEQIDNO：2(GenBank：AFD32413.1)。dbat-F：5′-GGAATTCATGGCAGGCTCAACAGAAT-3′；(下划线为EcoRⅠ酶切位点)dbat-R：5′-ATTTGCGGCCGCTCAAGGTTTAGTTA-3′；(下划线为NotⅠ酶切位点)实施例2DBAT突变酶的获得(一)利用全质粒PCR方法构建突变酶载体1、重组质粒pET-DBAT的质粒小量提取；2、以质粒pET-DBAT为模板，结合两端突变引物，利用重叠延伸PCR技术，扩增出含有突变位点的dbat质粒，PCR体系如下：所述的Primer-F和Primer-R需要根据不同的突变酶进行相应的变化，具体如表1所示。引物对D166AF和D166AR用于获得DBAT突变酶D166A，其氨基酸序列为SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DBAT突变酶R363H，其特征在于：所述的DBAT突变酶R363H是氨基酸序列为SEQ ID NO：2的DBAT酶的第363位氨基酸由Arg改变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO：14。

【技术特征摘要】
1.一种DBAT突变酶R363H，其特征在于：所述的DBAT突变酶R363H是氨基酸序列为SEQIDNO：2的DBAT酶的第363位氨基酸由Arg改变为His；其氨基酸序列为SEQIDNO：14。2.编码权利要求1所述的DBAT突变酶R363H的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：13。3.一种用于在宿主细胞内表达权利要求1所述的DBAT突变酶R363H的重组质粒。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。5.一种工程菌株，其特征在于：所述的工程菌株携带有权利要求4所述的重组质粒。6.根据权利要求5所述的工程菌株，其特征在于：所述的工程菌株为...

【专利技术属性】
技术研发人员：林俊芳，郭丽琼，尤琳烽，叶志伟，黄佳俊，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44