本发明专利技术公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明专利技术通过对P.macerans strain JFB05‑01(CCTCC NO:M208063)的CGTase的156位的丙氨酸(Ala)分别替换为赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)和缬氨酸(Val)，使染料木素糖基化效率分别提高了23％、44％和32％。这些突变酶比野生型CGTase更利于催化生产糖基化染料木素。
【技术实现步骤摘要】
一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法
本专利技术涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。
技术介绍
染料木素(又名金雀异黄素、染料木黄酮等)被认为是一种活性功能最高的大豆异黄酮类物质。在豆科植物中，染料木素经常以其葡萄糖苷衍生物即染料木苷(又名4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷)的形式存在。染料木素在人体及动物细胞中具有广泛的药理学功效。主要表现为：1)具有化学防癌(乳腺癌和前列腺癌等)作用。染料木素具有类雌性激素及抗激素作用，可以抑制肿瘤细胞合成过程中相关酶的活性，在肿瘤细胞形成过程中抑制肿瘤血管增生，延缓或阻止肿瘤变成癌细胞。2)可以预防心血管疾病。染料木素会激发低密度的脂蛋白受体产生正向调节作用，同时可以促进胆固醇的清除，抑制血小板的凝集，对于动脉粥样硬化等疾病具有预防和治疗作用。3)可以预防绝经后疾病。染料木素是典型的植物雌激素，所具有的雌激素活性能够缓解妇女更年期综合症及预防绝经后疾病。4)抗骨质疏松作用。染料木素的雌激素活性能够激活雌激素受体，提高成骨细胞活性；另外还可以增加骨密度，抑制骨量丢失，对骨质疏松具有较好的改善作用。然而，染料木素具有很强疏水性，几乎不溶于水，在一般的有机溶媒中溶解度较差，而易溶于二甲基亚砜等有机溶剂。由于染料木素在水溶液中的溶解度极低，不仅限制了其作为食品添加剂、化妆品以及其他水溶性产品的应用，而且也大大降低了其作为口服药物及静脉注射药剂的药用效果，限制了其医药行业中的应用。因此，如何提高染料木素在水溶液中的溶解度，成为目前国内外关注的焦点。其中研究较多的是染料木素的糖基化衍生物。据报道二葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分别是染料木素的3700倍和44000倍。糖基化染料木素相比与染料木素具有如下优点：1)与染料木素具有相似的生理生化功能；2)在体内水解为可被人体吸收的葡萄糖与染料木素，安全性较高；3)与染料木素相比水溶性明显的改善，拓展了其的应用范围。因此，糖基化染料木素具有十分重要的应用价值。环糊精葡萄糖基转移酶(EC2.4.1.19)是目前常见的催化糖基化反应的酶。但是，由于环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)对染料木素糖基化效率(转化率)较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对染料木素糖基化效率，将推动与染料木素糖基衍生物相关行业的快速发展。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种染料木素糖基化效率提高的环糊精糖基转移酶，与(GenBankaccessionno.JX412224)所示的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列相比，包括对第156位的丙氨酸进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillusmacerans)。在本专利技术的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的获得方法为以GenBankJX412224公布的基因为出发基因,将第156位的丙氨酸分别突变成谷氨酰胺A156N，赖氨酸A156K，缬氨酸A156V。编码所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列。表达述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；2)将步骤1)获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21得到基因工程菌。所述的克隆、转化方法为本领域常规的分子操作方法。本专利技术需要解决的另一个技术问题是提供一种所述的环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法，以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按2-4％接种量将种子液接至含75-100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30～37℃振荡培养至OD600＝0.6～0.8，加入0.01-0.02mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在23-25℃继续振荡培养一定时间85～95h后，将发酵液于4-6℃、8000-10000rpm离心15-20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液；经硫酸铵盐析，透析，以及镍柱亲和层析，获得较纯的环糊精葡萄糖基转移酶并冻干备用。本专利技术的有益效果：本专利技术构建了3个有意义的突变体，A156V，A156K及A156N，它们相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产糖基化染料木素时，转化率分别提高了32％，23％和44％。均实现了环糊精糖基转移酶对染料木素糖基化效率的提高，以麦芽糊精为糖基供体，染料木素为糖基受体，所产糖基化染料木素总产量均高于野生型CGTase，更利于糖基化染料木素工业化生产。附图说明图1不同反应时间下野生型CGTase和突变型酶催化染料木素糖基化反应的转化率。具体实施方式实施例1：染料木素糖基化效率提高的环糊精葡萄糖基转移酶本专利技术的环糊精糖基转移酶是在GenBankJX412224公布的基因序列基础上，对其成熟区156位点丙氨酸替换为其他氨基酸，具体获得了3种突变体，分别为A156K、A156V、A156N。可以通过化学全合成或PCR的方式将其成熟区的3个位点进行氨基酸的取代。实施例2：染料木素糖基化效率提高的环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法本例以PCR方法为例进行说明，但被专利技术的保护并不限于仅通过PCR方法获得突变的方法。突变体酶A156K、A156V、A156N的制备方法如下：1)定点突变突变体酶A156K、A156V及A156N的定点突变，以表达载体cgt/pET-20b(+)1(1.Han,R.Z.,Ge,B.B.,Jiang,M.Y.,Xu,G.C.,Dong,J.J.,andNi,Y.(2017)HighproductionofgenisteindiglucosidederivativeusingcyclodextringlycosyltransferasefromPaenibacillusmacerans,JIndMicrobiolBiot44,1343-1354.)为模板，引入A156K密码子的定点突变引物为：正向引物：5'-GCTTTGCAGAAAATGGTAAACTGTA-3'，下划线为突变碱基；反向引物：5'-GAGCCGTTATCATACAGTTTACCAT-3'，下划线为突变碱基。引入A156V密码子的定点突变引物为：正向引物：5'-GCAGAAAATGGTGTTCTGTAT-3'，下划线为突变碱基；反向引物：5'-GTTATCATACAGAACACCATT-3'，下划线为突变碱基。引入A156N密码子的定点突变引物为：正向引物：5'-GCAGAAAATGGTAACCTGTATGATA-3'，下划线为突变碱基；反向引物：5'-GCCGTTATCATACAGGTTACCAT-3'，下划线为突变碱基。PCR反应体系均为：5×PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)5μL，2.5mMdNTPs4μL,10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA1μL，2.5U/μLPrimeSTARTaqHS0.5μL，加入双蒸水至50μL；PCR产物扩增条件均为：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环糊精糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体与(GenBank accession no.JX412224)所示的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列相比，包括对第156位的丙氨酸进行突变。
【技术特征摘要】
1.一种环糊精糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体与(GenBankaccessionno.JX412224)所示的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列相比，包括对第156位的丙氨酸进行突变。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillusmacerans)。3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶的获得方法为以GenBankJX412224公布的基因为出发基因,将第156位的丙氨酸分别突变成谷氨酰胺A156N，赖氨酸A156K，缬氨酸A156V。4.编码权利要求1-3任一所述突变体的核苷酸片段。5.含有编码权利要求1-3任一所述突变体的基因的载体。6.表达权利要求1-3任一所述突变体的基因工程菌或转基因细胞系。7.一种构建权利要求6所述基因工程菌方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述环糊精葡萄糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩瑞枝，倪晔，葛彬彬，姚栋，董晋军，许国超，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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