pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体及构建方法及SEPT8基因干扰片段和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及pEGFP‑N1/SEPT8真核表达载体及构建方法及SEPT8基因干扰片段和应用。本发明专利技术的pEGFP‑N1/SEPT8真核表达载体的序列具有SEQ ID NO:1所示的序列。该pEGFP‑N1/SEPT8真核表达载体的构建方法具有操作简单、操作难度低的优点。SEPT8基因的siRNA干扰片段，包括siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4四个。SEPT8基因的siRNA干扰片段在制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的应用，具有深远的开发价值。

PEGFP-N1/SEPT8 eukaryotic expression vector and construction method, SEPT8 gene interference fragment and Application

The invention relates to the field of genetic engineering technology, in particular to the eukaryotic expression vector pEGFP_N1/SEPT8, the construction method and the SEPT8 gene interference fragment and application. The sequence of the pEGFP N1/SEPT8 eukaryotic expression vector of the invention has a sequence shown by SEQ ID NO:1. The construction of the pEGFP N1/SEPT8 eukaryotic expression vector has the advantages of simple operation and low operational difficulty. The siRNA interference fragments of SEPT8 gene include four siRNA1, siRNA2, siRNA3 and siRNA4. The siRNA interference fragment of SEPT8 gene has a far-reaching development value in the preparation of tumor cells for inhibiting migration and invasion.

【技术实现步骤摘要】
pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体及构建方法及SEPT8基因干扰片段和应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体及构建方法及SEPT8基因干扰片段和应用。
技术介绍
septin8(SEPT8)基因定位于人染色体5q31.1，是Septin基因家族成员之一。Septin蛋白是构成细胞骨架的主要成分，并在细胞内物质运输、细胞分裂、细胞周期调控与凋亡等过程中发挥重要作用。近年来发现SEPT8在鳞状细胞癌(SCC)等恶性肿瘤中呈高表达状态，并且与患者预后不良相关。迄今为止，尚未见SEPT8在胃癌细胞中的表达以及细胞功能实验研究的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于针对现有技术的不足，提供pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体。本专利技术的目的之二在于针对现有技术的不足，提供pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的构建方法。本专利技术的目的之三在于针对现有技术的不足，提供SEPT8基因的siRNA干扰片段。本专利技术的目的之四在于针对现有技术的不足，提供SEPT8基因的siRNA干扰片段的应用。为了实现上述目的之一，本专利技术采用如下技术方案：提供pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体，所述pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的序列具有SEQIDNO:1所示的序列。为了实现上述目的之二，本专利技术采用如下技术方案：提供pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的构建方法，它包括以下步骤：步骤一，在NCBI上查找SEPT8(NM_001098811.1)的序列作为目的基因序列，然后设计出引物SEPT8-P1、SEPT8-P2；其中，引物SEPT8-P1的序列具有SEQIDNO:2所示的序列，引物SEPT8-P2的序列具有SEQIDNO:3所示的序列；所述目的基因序列具有SEQIDNO:4所示的序列；步骤二，用引物SEPT8-P1、SEPT8-P2扩增目的基因序列，其中，目的基因序列的两端分别含酶切位点NheI和HindIII；步骤三，目的基因序列经NheI和HindIII消化后与载体pEGFP-N1连接，得到重组载体pEGFP-N1/SEPT8，即为所述pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体。为了实现上述目的之三，本专利技术采用如下技术方案：提供SEPT8基因的siRNA干扰片段，包括siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4四个干扰片段；所述siRNA1干扰片段具有SEQIDNO:5所示的序列；所述siRNA2干扰片段具有SEQIDNO:6所示的序列；所述siRNA3干扰片段具有SEQIDNO:7所示的序列；所述siRNA4干扰片段具有SEQIDNO:8所示的序列。为了实现上述目的之四，本专利技术采用如下技术方案：提供SEPT8基因的siRNA干扰片段的应用，在制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的应用。本专利技术与现有技术相比较，有益效果在于：(1)本专利技术的pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体，该pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体转染胃癌细胞后，对细胞增殖和克隆形成无明显影响，但能提高细胞横向和纵向迁移率，并能提高细胞的侵袭率。(2)本专利技术的pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的构建方法，该pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的构建方法具有操作简单、操作难度低的优点。(3)本专利技术提供的SEPT8基因的siRNA干扰片段，转染胃癌细胞后，对细胞增殖和克隆形成无明显影响，但能降低细胞横向和纵向迁移率，并能降低细胞的侵袭率。(4)本专利技术提供的SEPT8基因的siRNA干扰片段的应用，在制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的应用，具有深远的开发价值。附图说明图1是pEGFP-N1表达载体的图。图2是RT-qPCR检测过表达SEPT8的mRNA表达改变图。图3是Westernblot检测过表达SEPT8后蛋白的改变图。图4是CCK-8检测过表达SEPT8对细胞增殖的影响图。图5是平板克隆形成实验图。图6是细胞划痕实验：实验组细胞愈合明显比对照组快的对比图。图7是Transwell细胞迁移实验检测过表达SEPT8对细胞迁移的影响图。其中，*：P<0.05。图8是Transwell细胞侵袭实验检测过表达SEPT8对细胞迁移的影响图。其中，*：P<0.05。图9是RT-qPCR检测SEPT8基因干扰片段干扰效率的结果图。其中，*：P<0.05。图10是Westernblot检测干扰SEPT8基因后蛋白改变的结果图。其中，*：P<0.05。图11是干扰SEPT8基因后对MGC-803细胞增殖的影响图。图12是干扰SEPT8基因后对MGC-803细胞克隆形成的影响图。图13是干扰SEPT8基因后对MGC-803细胞横向迁移的影响图。其中，*：P<0.05。图14是干扰SEPT8基因后对MGC-803细胞纵向迁移的影响图。其中，*：P<0.05。图15是干扰SEPT8基因后对MGC-803细胞侵袭的影响图。其中，*：P<0.05。具体实施方式为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。其中，本专利技术提及的NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)是指美国国立生物技术信息中心。实施例1。pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体，该pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的序列具有SEQIDNO:1所示的序列。实施例2。实施例1的pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的构建方法，它包括以下步骤：步骤一，在NCBI上查找SEPT8(NM_001098811.1)的序列作为目的基因序列，然后设计出引物SEPT8-P1、SEPT8-P2；其中，引物SEPT8-P1的序列具有SEQIDNO:2所示的序列，引物SEPT8-P2的序列具有SEQIDNO:3所示的序列；所述目的基因序列具有SEQIDNO:4所示的序列；步骤二，用引物SEPT8-P1、SEPT8-P2扩增目的基因序列，其中，目的基因序列的两端分别含酶切位点NheI和HindIII；步骤三，目的基因经NheI和HindIII消化后与真核表达载体pEGFP-N1连接，得到重组载体pEGFP-N1/SEPT8，即为所述pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体。实施例3。实施例2的SEPT8基因的siRNA干扰片段，包括siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4四个干扰片段；siRNA1干扰片段具有SEQIDNO:5所示的序列；siRNA2干扰片段具有SEQIDNO:6所示的序列；siRNA3干扰片段具有SEQIDNO:7所示的序列；siRNA4干扰片段具有SEQIDNO:8所示的序列。实施例4。实施例3的SEPT8基因的siRNA干扰片段的应用，在制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的应用。实验：1.1SEPT8基因在胃癌细胞的过表达验证把构建的pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体转染胃癌细胞，转染24h后提取RNA，48h后提蛋白，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.pEGFP‑N1/SEPT8真核表达载体，其特征在于：所述pEGFP‑N1/SEPT8真核表达载体的序列具有SEQ ID NO:1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体，其特征在于：所述pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的序列具有SEQIDNO:1所示的序列。2.权利要求1的pEGFP-N1/SEPT8真核表达载体的构建方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一，在NCBI上查找SEPT8(NM_001098811.1)的序列作为目的基因序列，然后设计引物SEPT8-P1、SEPT8-P2；其中，引物SEPT8-P1的序列具有SEQIDNO:2所示的序列，引物SEPT8-P2的序列具有SEQIDNO:3所示的序列；所述目的基因序列具有SEQIDNO:4所示的序列；步骤二，用引物SEPT8-P1、SEPT8-P2扩增目的基因序列，其中，目的基因序列的两端分别含酶切位点NheI和HindIII；步骤三...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志刚，欧阳平，杜进林，潘海燕，于海兵，黄明元，李华文，林博德，何荣威，张诗茁，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44