白洗猪LYRM1基因真核载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种白洗猪LYRM1基因真核载体的构建方法。本发明专利技术能在构建白洗猪LYRM1基因真核载体时，免除从组织中提取蛋白的繁琐步骤，简化操作。本发明专利技术通过简单的方法克隆白洗猪LYRM1基因并构建真核表达载体，为白洗猪基因检测方法的建立提供基础，可从细胞生物学探究LYRM1蛋白对脂肪形成的影响，为白洗猪的从分子选种培育提供理论依据。

【技术实现步骤摘要】
白洗猪LYRM1基因真核载体的构建方法
本专利技术属于生物
，尤其是一种白洗猪LYRM1基因真核载体的构建方法
技术介绍
LYRM1基因是利用抑制性差减杂交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)技术，从肥胖网膜脂肪组织中筛选出的特异性高表达基因，属于LYR家族，LYRM蛋白被鉴定为线粒体OXPHOS复合物的辅助亚基或装配因子，且已被证明与古代线粒体蛋白质有相互作用。RT-PCR检测表明LYRM1基因广泛表达于不同组织中，但在脂肪组织中表达水平最高，并具有调节前脂肪细胞池大小和影响脂肪组织稳态的潜力。邱洁等(2009)研究表明对人前体细胞株诱导分化的第2天时LYRM1基因的核酸和蛋白表达水平显著上调。Zhang等(2012)对LYRM1基因的研究表明其具有促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖和抑制其凋亡的作用。Zhu等(2010)对LYRM1基因的研究表明可显著增加胚胎干细胞P19细胞的增殖，认为LYRM1可能具有调节细胞生长，凋亡和心脏发育的潜力，对LYRM1基因的多态性研究显示，LYRM1基因可作为影响秦川牛体重和肉质特征的辅助选择。专本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白洗猪LYRM1基因真核载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：提取白洗猪皮下脂肪组织的RNA，经逆转录获得白洗猪的cDNA，将cDNA经PCR扩增获得LYRM1基因的CDS区序列，将扩增后产物胶回收与Pucm‑T载体连接，转化进入TOP10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落经LB液体培养基扩培，PCR检测验证，质粒提取测序验证；回收重组质粒和pEGFP‑N3载体的双酶切的目的片段进行连接，获得pEGFP‑N3(+)‑LYRM1重组载体；所述的引物包括上游引物Xho Ⅰ和下游引物Kpn Ⅰ，其中上游引物Xho Ⅰ F的序列5‑

【技术特征摘要】
1.一种白洗猪LYRM1基因真核载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：提取白洗猪皮下脂肪组织的RNA，经逆转录获得白洗猪的cDNA，将cDNA经PCR扩增获得LYRM1基因的CDS区序列，将扩增后产物胶回收与Pucm-T载体连接，转化进入TOP10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落经LB液体培养基扩培，PCR检测验证，质粒提取测序验证；回收重组质粒和pEGFP-N3载体的双酶切的目的片段进行连接，获得pEGFP-N3(+)-LYRM1重组载体；所述的引物包括上游引物XhoⅠ和下游引物KpnⅠ，其中上游引物XhoⅠF的序列5-CCGCTATGACAACGGCAACACGACAA-3’；单下划线部分为保护碱基，双下划线部分为酶切位点；下游引物KpnⅠR的序列：5’-CGGGGAAACCTCATCGTGAGACTG-3’；单下划线部分为保护碱基，双下划线部分为酶切位点。2.根据权利要求1所述的白洗猪LYRM1基因真核载体的构建方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为：所述的PCR扩增的反应总体系20ul:上、下游引物各1.0μL，模板cDNA1.0μL，2×EsTaqMasterMix10μL，ddH2O7μL，PCR的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈祥，苑红霞，韦仕南，骆金红，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52