【技术实现步骤摘要】
一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法
本专利技术提供了一种基于高通量测序技术检测人类胚胎中α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法,属于基因检测
技术介绍
地中海贫血(以下简称“地贫”)是世界上最常见的人类单基因遗传血液病之一,被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病,也是中国南方各省最常见、危害最大的遗传病。在我国南方α-地贫的高发区,总发病率为2.46%,其中广西、广东、江西、四川和浙江各省(区)的发病率分别为14.95%、4.11%、2.60%、1.92%和1.20%。地贫分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。目前,α-地贫还没有效的根治方法,主要以预防为主。因此开展检测,提早发现贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。随着下一代测序技术的广泛应用,单基因遗传性疾病相关检测也发展较快。针对多种疾病相关的Panel检测也不断应用,在欧美发达国家结合核酸质谱技术、基因芯片技术等开展近3000多个单基因遗传疾病的检测项目,我国的单基因疾病检测也在不断发展中,已由传统只检测几个基因突变位点的一代测序技术、Real-timePCR技术逐步地向多基因多位点检测方面扩展。传统PCR虽然灵敏,但应用于PGD的时候,存在污染、等位基因脱扣、扩增失败等缺点。单细胞PCR的扩增失败率大约是5%~10%。扩增失败可能与样本的准备过程有关,如未移入细胞、靶DNA的丢失和变性以及细胞的裂解过程。污染是导致误诊的重要原因,通过设立严格的阴性和阳性对照、严格的实验室操作以及单精子卵胞浆内注射技术的应用可以减少污染。等位基因脱扣(alleled ...
【技术保护点】
1.一种检测人类胚胎α‑地中海贫血基因突变的引物组合,其特征在于:所述引物组合由SEQ ID NO:1~1354所示序列的多重PCR引物组成。
【技术特征摘要】
1.一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合,其特征在于:所述引物组合由SEQIDNO:1~1354所示序列的多重PCR引物组成。2.一种基于高通量测序平台检测α-地中海贫血基因突变的方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)胚胎细胞全基因组扩增和夫妻双方全血DNA提取:将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集,和全血DNA提取,得到DNA后进行浓度测定;(2)目的片段扩增:将DNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合,经多重PCR反应,得到目的基因DNA片段;(3)引物消除:将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应,降解去除PCR扩增片段中的引物序列,得到去引物的DNA片段;(4)接头连接:将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应,得到加接头的DNA片段;(5)磁珠纯化:将加接头的DNA片段进行磁珠纯化,去除多余的小片段接头,得到纯化的DNA片段;(6)文库扩增:将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增,并采用磁珠进行纯化,得到小片段的DNA文库;(7)文库检测:将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度;(8)高通量测序:采用IonProton或IonPGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序;(9)生物信息学分析:对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序进行生物信息学SNP分析,获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息,再根据胚胎样本的测序信息判断是否遗传了父母亲的致病单体型。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中所述的多重PCR反应条件如下:99℃预变性2min,1个循环;99℃变性15sec,60℃退火和延伸4min,22个循环;10℃终止。4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述步骤(4)中所述的P1接头如下:5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’和5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’;所述特异性接头是由如下正反两个序列组成的Barcodex:5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’和5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’,Barcodex代表的具体序列如下:Barcode1:5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’;Barcode2:5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’;Barcode3:5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’;Bar...
【专利技术属性】
技术研发人员:邓红辉,卢绍月,方雅亮,
申请(专利权)人:广州达瑞生殖技术有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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