本发明专利技术涉及创伤修复材料技术领域，特别涉及一种具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。该DNA分子依次由编码YKYKY短肽的基因片段、编码甘氨酸柔性链的基因片段和编码EGF的基因片段连接而成。本发明专利技术通过黏附基团将EGF固定于材料表面，使其在保持EGF原有生物活性的基础上，具有了与多种创伤修复材料紧密结合的能力，以达到促进细胞在材料表面黏附、增殖及成皮分化的能力，从而增加其在患处作用的持续性和稳定性，减少了表皮细胞生长因子的用量，大大降低了其产生副作用的风险。
Epidermal growth factor with adhesion ability and its coding gene, preparation method and Application
The invention relates to the technical field of wound repair materials, in particular to an epidermal growth factor with adhesion ability and its coding gene, a preparation method and a wound repair material. The DNA molecule is sequentially composed of a gene fragment encoding YKYKY short peptide, a gene fragment encoding glycine flexible chain and a gene fragment encoding EGF. The invention fixes EGF on the surface of the material by adhering groups so that it has the ability to bind tightly with various wound repair materials on the basis of maintaining the original biological activity of EGF, so as to achieve the ability to promote cell adhesion, proliferation and skin differentiation on the surface of the material, thereby increasing the sustainability and stability of its role in the affected area. Sex, reducing the amount of epidermal growth factor, greatly reducing the risk of side effects.
【技术实现步骤摘要】
具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和应用
本专利技术涉及创伤修复材料
，特别涉及一种具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。
技术介绍
由烧伤、机械性外伤、疾病并发症及药物副作用等因素引起的皮肤损伤是临床最常见的组织损伤，如果不及时处理，往往会发展成经久不愈的全皮层损伤，不仅影响美观，还会给患者的生活带来诸多的不便。表皮细胞生长因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)是目前在皮肤修复领域商品开发程度最高，应用最广的一种生长因子。大量研究表明，EGF对多种细胞的增殖和成熟都具有明显的促进作用，而担载EGF的创伤修复材料(纤维膜、可吸收医用棉、微载体等)也可以有效的促进皮肤组织的损伤修复。但是，由于EGF在游离状态下的半衰期较短，且极易被体液和血液冲刷稀释而流逝，因此很难保持其在患处作用的持续性和稳定性。而且，已有研究表明，EGF具有潜在的成瘤性，因此，大剂量或反复的滥用无疑会提高EGF产生副作用的风险。通过一定方法，将EGF固定于创伤修复材料的内部或表面，使其稳定的发挥生物活性，对于创伤修复具有深远的意义。ItxasoGarcia-Orue等利用共混后静电纺丝的方法制备了混有EGF的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米纤维膜，有效的控制了EGF的释放，增强了其作用效果。HyeminKim等用共价结合的方法将EGF与透明质酸相连接，制成含有EGF的透明质酸贴片，应用于皮肤修复，也取得了良好的效果。近几十年，越来越多的人开始关注天然胶粘剂的粘附机理以试图发展仿生粘合剂。海洋贻贝黏附蛋白中，含有大量的左旋3，4-二羟基苯丙氨酸(或L-多巴，L-DOPA)与赖氨酸(Lysine，K)单元。其中，L-DOPA在水溶液中能够氧化自我聚合形成薄膜，可以实现潮湿环境中对各种材料的超强附着，如金属、氧化物、合成高分子聚合物和陶瓷材料等，甚至典型的抗粘附性材料，如聚四氟乙稀(PTFE)，而赖氨酸也常用于与材料的黏附来改善材料的亲水性。传统的用于材料表面固定生长因子等生物活性蛋白的方法有通过共价结合和物理吸附两种方法。然而，化学共价结合往往需要多步骤以及复杂的程序，比如需要通过预处理对材料表面进行活化，或者需要氧等离子、紫外等照射、亦或者添加其他化学物质。这种改性会明显改变材料的整体性质，甚至导致材料表面变性。此外，使用的化学品进行表面活化和固定化，例如N-羟基琥珀酰亚胺和马来酰亚胺通常易发生水解，这会导致在聚合物上表面蛋白质或肽的聚合。而物理吸附，作为另一种常用的固化蛋白，多肽及生长因子的方法，吸附效率较低。因此，一种简单、可靠、高效的蛋白表面固定方法对微载体表面进行改性将会有良好的应用前景。通过基因重组表达或固相合成制备含有材料黏附结构基团的生长因子，是目前较为先进的一种材料表面固定生长因子的方法。但是，现阶段制备的各种具有黏附基团的生长因子，绝大多数都只特异性对某些生物大分子(胶原、层黏连蛋白、透明质酸等)有黏附能力，而对于高分子材料、无机材料和金属材料等具有黏附能力的生长因子则鲜有报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种具有黏附能力的表皮细胞生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。本专利技术制备的创伤修复材料，通过黏附基团将EGF固定于包括高分子材料、无机材料和金属材料等惰性材料在内的多种材料表面，使其在保持EGF原有生物活性的基础上，具有了与多种创伤修复材料紧密结合的能力，以达到促进细胞在材料表面黏附、增殖及成皮分化的能力。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种DNA分子，该DNA分子依次由编码YKYKY短肽的基因片段、编码甘氨酸柔性链的基因片段和编码表皮细胞生长因子(EGF)的基因片段连接而成。其中，YKYKY短肽的氨基酸序列为Tyr-Lys-Tyr-Lys-Tyr。在本专利技术中，该DNA分子可以为YKYKY-甘氨酸柔性链-EGF，也可以为EGF-甘氨酸柔性链-YKYKY。本专利技术通过基因重组表达技术大量的制备了在氮末端含有YKYKY短肽的EGF，再通过酪氨酸酶促羟化反应，将YKYKY短肽中的酪氨酸转化为L-DOPA，从而得到在氮末端具有材料黏附基团的重组表皮细胞生长因子(DKDKD-EGF)。通过L-DOPA(含儿茶酚官能团)在微碱性环境下发生物理和化学交联，在材料的表面形成聚多巴层，从而实现EGF在多种组织工程材料表面的黏附。该方法可以用于制备黏附有表皮细胞生长因子的可吸收医用棉、创面敷料、细胞微载体、细胞培养板和人工皮肤移植物等。作为优选，编码甘氨酸柔性链的基因片段为编码4～10个甘氨酸的基因片段。优选地，编码甘氨酸柔性链的基因片段为编码6个甘氨酸的基因片段。在本专利技术提供的实施例中，DNA分子的碱基序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供了一种蛋白质，其氨基酸序列的结构基因的碱基序列为上述任一DNA分子。本专利技术还提供了该蛋白质的制备方法，包括：将上述任一DNA分子插入质粒，再将重组质粒转入原核表达载体中，表达蛋白，得到蛋白质YKYKY-EGF。在本专利技术提供的具体实施例中，质粒为pET15b质粒。在本专利技术提供的具体实施例中，原核表达载体为BL21(DE3)型大肠杆菌。在本专利技术提供的具体实施例中，表达蛋白后还包括纯化、复性的步骤。本专利技术还提供了一种蛋白质，蛋白质YKYKY-EGF的YKYKY短肽中的1个或几个L-酪氨酸替换为L-DOPA。作为优选，蛋白质YKYKY-EGF的YKYKY短肽中的3个L-酪氨酸替换为L-DOPA，得到DKDKD-EGF。本专利技术还提供了该蛋白质DKDKD-EGF的制备方法，包括：蛋白质YKYKY-EGF在酪氨酸酶催化作用下得到。作为优选，蛋白质DKDKD-EGF的制备方法具体为：将维生素C、PBS和蛋白质YKYKY-EGF混合，加入酪氨酸酶，24～26℃条件下静置1.5～2.5h。在本专利技术提供的具体实施例中，该蛋白质的制备方法具体为：将维生素C、PBS和蛋白质YKYKY-EGF混合，加入酪氨酸酶，25℃条件下静置2h。在本专利技术提供的具体实施例中，蛋白质DKDKD-EGF的制备方法具体为：将5mg/mL的维生素C溶液(pH7.0)，PBS(pH7.0)和100μg/mL的重组蛋白溶液(pH7.0)按照1:1:1的体积比例混合，并1U/μg重组蛋白的比例向混合溶液中加入酪氨酸酶，25℃条件下静置反应2h。本专利技术还提供了一种黏附有表皮细胞生长因子的创伤修复材料，创伤修复材料为黏附有蛋白质DKDKD-EGF的载体材料。作为优选，载体材料为可吸收医用棉、创面敷料、细胞微载体、细胞培养板或人工皮肤移植物。在本专利技术提供的实施例中，载体材料为PLGA静电纺丝膜。本专利技术还提供了该创伤修复材料的制备方法，将含有蛋白质DKDKD-EGF的溶液的pH值调至8.0～9.0，得到碱性蛋白溶液；将载体材料浸入碱性蛋白溶液中，在24～26℃条件下放置6～10h；或者将含有蛋白质YKYKY-EGF的溶液、酪氨酸酶和载体材料混合，24～26℃条件下静置1.5～2.5h，pH值调至8.0～9.0，在24～26℃条件下放置6～10h。在本专利技术提供的实施例中，创伤修复材料的制备方法为：将含有蛋白质DKDKD-EGF的溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子依次由编码YKYKY短肽的基因片段、编码甘氨酸柔性链的基因片段和编码表皮细胞生长因子的基因片段连接而成。
【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子依次由编码YKYKY短肽的基因片段、编码甘氨酸柔性链的基因片段和编码表皮细胞生长因子的基因片段连接而成。2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述编码甘氨酸柔性链的基因片段为编码4～10个甘氨酸的基因片段。3.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的碱基序列如SEQIDNO：1所示。4.一种蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列的结构基因的碱基序列为权利要求1至3中任一项所述DNA分子。5.如权利要求4所述蛋白质的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1至3中任一项所述DNA分子插入质粒，再将重组质粒转入原核表达载体中，表达蛋白。6.一种蛋白质，其特征在于，权利要求4所述蛋白质的YKYKY短肽中的1个或几个L-酪氨酸替换为L-DOPA。7.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：章培标，武振旭，陈利，王宇，王宗良，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22
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