本发明专利技术公开了一种预防弓形虫感染的减毒活疫苗，该疫苗含有同时缺失了乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)基因和乳酸脱氢酶1(LDH1)基因的弓形虫疫苗虫株，其中，乳清酸磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术用于预防动物弓形虫病的减毒弓形虫活疫苗，其疫苗虫株由于敲除了OPRT和LDH1两个基因，具有毒力弱、几乎没有致病性的优点，能够用于预防动物的弓形虫感染，有成为制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。
【技术实现步骤摘要】
缺失OPRT和LDH1基因的弓形虫减毒活疫苗及其制备方法
本专利技术属于基因工程领域，涉及预防弓形虫感染的减毒活疫苗，尤其是缺失乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)和乳酸脱氢酶1(LDH1)基因的弓形虫减毒活疫苗，本专利技术还涉及该疫苗的制备方法。
技术介绍
弓形虫可以感染包括人在内的几乎所有的温血动物，引起人畜共患弓形虫病。人和动物主要由于误食被弓形虫和其卵囊污染的肉类而感染，全球大概有1/3的人存在弓形虫感染。当人体免疫力正常，感染弓形虫时一般不会表现明显的临床症状，而在免疫缺陷的个体中，感染弓形虫则会导致发烧、失明、脑炎等，严重威胁人类的生命健康。在畜牧业生产中，弓形虫感染导致猪、羊等动物的流产、死胎、畸形胎儿，造成重大的经济损失。然而，针对弓形虫病的预防至今没有良好的疫苗，DNA等亚单位疫苗仅能产生极低的部分免疫保护效果且处于科研阶段，目前市场上唯一的商品化弓形虫疫苗是从羊流产死胎中分离得到的弓形虫S48株，通过在实验室传统传代致弱后制备，该疫苗存在着毒力返强的风险，且并不适用于我国的畜牧业养殖中。尿苷酸(UMP)是所有其他嘧啶核苷酸的前体，是组成RNA的重要核苷酸之一。弓形虫体内的尿苷酸的合成有两个途径，从头途径和补救途径。其中从头途径是合成尿苷酸的最主要途径，补救途径合成的量不能满足弓形虫的需要。乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)是弓形虫尿苷酸从头合成途径中的一个关键酶，它可催化乳清酸与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)作用获得磷酸核糖形成乳清酸核苷酸。弓形虫体内尿苷酸含量不足则会引起严重的遗传损伤，使弓形虫丧失复制的能力，进而影响其对宿主的毒力。此外，本研究小组前期开发出了一种缺失乳酸脱氢酶1(LDH1)的弓形虫突变体，发现该突变体能在体外正常生长，但感染动物后不能在体内复制，显著降低致病性。基于弓形虫病防治存在的问题和本课题组的前期研究基础，我们采用基因编辑技术，构建具有良好免疫原性和免疫保护力的减毒弓形虫疫苗虫株，对于人类健康和畜牧养殖业的发展均有重要价值和意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种预防弓形虫感染的减毒活疫苗及其制备方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种预防弓形虫感染的减毒活疫苗，该疫苗含有同时缺失了乳清酸磷酸核糖转移酶基因和乳酸脱氢酶1基因的弓形虫疫苗虫株，其中，乳清酸磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。该疫苗的制备方法包括以下步骤：1.弓形虫疫苗虫株的构建：1)出发虫株为具有乳清酸磷酸核糖转移酶基因和乳酸脱氢酶1基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述乳清酸磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgoprt质粒的构建:以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，利用上下游引物扩增，将MIC3靶点特异的gRNA替换为乳清酸磷酸核糖转移酶基因靶点特异的gRNA，转换DH5α得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgoprt质粒，其中，上游引物gRNA-oprt-Fw:5’–GTCCAGGAGTAAGACCCGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’，下游引物gRNA-R：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；3)oprt-5UTR::loxp-DHFR-loxp::oprt-3UTR同源模板的制备：将乳清酸磷酸核糖转移酶基因的5’同源臂，3’同源臂和带有loxp位点的DHFR药物筛选标记进行连接所得；4)弓形虫基因敲除虫株△oprt::DHFR的获得：将步骤1)中虫体悬液与步骤2)中得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgoprt质粒以及步骤3)得到的oprt-5UTR::loxp-DHFR-loxp::oprt-3UTR同源模板片段混匀后通过电转化制得弓形虫基因敲除虫株△oprt::DHFR；5)△oprt::DHFR虫株DHFR药物筛选标签的删除：通过Cre质粒对△oprt::DHFR虫株中插入的DHFR序列进行切除；6)pSAG1-Cas9-TgU6-sgldh1质粒的构建：以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，利用上下游引物扩增，将MIC3靶点特异的gRNA替换为乳酸脱氢酶1基因靶点特异的gRNA，转换DH5α得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgldh1质粒，其中，上游引物gRNA-ldh1-Fw：5’–GCCGGTCTGACCAAGGTGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’，下游引物gRNA-R为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；7)ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR同源模板的制备：将从含有乳酸脱氢酶1基因的5’同源臂，3’同源臂的以及pUC19载体片段的pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR质粒中扩增得到的大片段和带有loxp位点的DHFR药物筛选标记片段进行连接所得；8)弓形虫基因敲除虫株△oprt△ldh1::DHFR的获得：将步骤5)中构建的虫株悬液与步骤6)中得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgldh1质粒以及步骤7)得到的ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR同源模板片段混匀后通过电转化制得弓形虫基因敲除虫株△oprt△ldh1::DHFR；9)弓形虫基因敲除虫株△oprt△ldh1::DHFR药物筛选标签的删除：通过Cre质粒对弓形虫基因敲除虫株△oprt△ldh1::DHFR中插入的DHFR序列进行切除。其中，所述oprt-5UTR::loxp-DHFR-loxp::oprt-3UTR同源模板的制备具体为：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，扩增oprt-5’UTR和oprt-3’UTR，从带loxp-DHFR-loxp的质粒中扩增获得loxp-DHFR-loxp片段，利用所设计引物线性化pUC19载体，通过多片段连接酶ExnaseTMMultiS连接各个片段，构建重组质粒poprt-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::oprt-3UTR，利用高保真酶KDPlus对poprt-5UTR::loxp-DHFR-loxp::oprt-3UTR质粒进行PCR扩增目的片段oprt-5UTR::loxp-DHFR-loxp::oprt-3UTR。其中，所述ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR同源模板的制备具体为：设计带有同源臂的引物利用高保真酶KDplus从质粒pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR中扩增ldh1-5UTR-pUC19-3UTR-ldh1片段，从含有loxp-DHFR-loxp片段的的质粒中扩增loxp-DHFR-loxp片段，通过多片段连接酶ExnaseTMMultiS连接各个片段，构建重组质粒pldh1-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR，利用高保真酶KDPlus对pldh1-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::ldh1-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种预防弓形虫感染的减毒活疫苗，其特征在于：含有同时缺失了乳清酸磷酸核糖转移酶基因和乳酸脱氢酶1基因的弓形虫疫苗虫株，其中，乳清酸磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种预防弓形虫感染的减毒活疫苗，其特征在于：含有同时缺失了乳清酸磷酸核糖转移酶基因和乳酸脱氢酶1基因的弓形虫疫苗虫株，其中，乳清酸磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。2.如权利要求1所述的预防弓形虫感染的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)出发弓形虫虫株具有乳清酸磷酸核糖转移酶基因和乳酸脱氢酶1基因，所述乳清酸磷酸核糖转移酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：申邦，周太芳，夏宁波，赵俊龙，周艳琴，方瑞，贺兰，潘明，崔建敏，杨旭柯，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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