预防贾第虫病的二价DNA疫苗及其肠溶制剂制造技术

本发明专利技术公开了一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，其中将贾第虫的两种抗原基因α1-giardin和CWP-2分别插入真核载体pVAX1中获得重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2，将所述重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，所述重组菌构成本发明专利技术的二价DNA疫苗。本发明专利技术创造性地提出分别针对滋养体和包囊两个阶段联合应用的抗贾第虫病二价DNA疫苗，实现了抑制滋养体的形成从而阻断致病以及抑制包囊的形成从而切断传播，克服了以往疫苗研发中疫苗作用单一的缺点。本发明专利技术的二价DNA疫苗本发明专利技术还实现了稳定性传代和保护性的持续。本发明专利技术还公开了一种定量包含所述二价DNA疫苗的肠溶制剂及其制备方法。

【技术实现步骤摘要】
预防贾第虫病的二价DNA疫苗及其肠溶制剂
本专利技术涉及疫苗领域，具体涉及预防人和动物贾第虫病的二价DNA疫苗及其肠溶制剂。
技术介绍
蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia，简称贾第虫)为人体致病性原虫，可导致腹泻、营养吸收不良综合症及儿童生长障碍。全世界每年出现约50万新感染病例，在艾滋病患者中感染率极高(大约有20％-50％)，已被世界卫生组织列为全世界危害人类健康的十种主要寄生虫病之一。此外，贾第虫可感染40多种动物，为典型的人畜共患病，是危害我国畜牧业发展的重要寄生虫之一。贾第虫的生活史包括滋养体(trophozoite)和包囊(cyst)两个发育阶段，以及出囊和成囊两个过程。滋养体为虫体的营养和繁殖期(或致病期)，当人和某些哺乳动物食入包囊，其在小肠内出囊形成滋养体并寄生于此，导致以腹泻和消化不良为主的蓝氏贾第鞭毛虫病(Giardiasis，简称贾第虫病)。包囊为静止期(或感染期)，由滋养体在结肠内分泌囊壁物质形成(成囊)，之后随宿主粪便排出体外，经口感染新的宿主，平均每10个包囊就可以导致宿主感染，在宿主小肠内脱囊形成滋养体而致病。目前，临床上治疗贾第虫病的首选药物是甲硝唑(metronidazole)。该药虽有较好的疗效，但也有显著的不良反应，最常见的是胃肠道反应，严重者可出现消化道大出血；部分患者还可出现神经系统症状，血液系统反应，甚至心肌炎。另外，因其对胎儿的致畸作用，而为孕妇所禁忌。上述不良反应极大地限制了甲硝唑在本病治疗中的应用。此外，贾第虫感染多呈慢性，患者病程长，该药用量大，疗程长。在长期药物治疗过程中，作为本虫致病阶段的滋养体因耐药而形成具有传播作用的包囊。包囊的囊壁厚实具有保护作用，甲硝唑分子难以穿透囊壁，丧失了对包囊的杀伤作用，无法阻断贾第虫病的传播。抗贾第虫疫苗的研发是控制贾第虫传播和致病的重要手段。目前抗贾第虫疫苗的研发尚处于初级阶段，以贾第虫滋养体的粗蛋白提取物作为免疫原的兽用疫苗是唯一商品化的抗贾第虫疫苗产品。然而，该产品不能控制动物包囊的排出，因而不能切断传播途径。α-giardin是定位于贾第虫滋养体浆膜表面的一组胶连蛋白(Annexin)，在贾第虫包囊向滋养体转化(出囊)及滋养体的感染粘附过程中发挥重要作用。其中α1-giardin是分子量最小的α-giardin，只含有Annexin的核心结构，具有很强的免疫原性，在感染初期产生，存在于整个感染过程中，可以作为血清学诊断的标记性分子。此外，α1-giardin在不同的贾第虫致病株之间相对保守，包括序列同源性(氨基酸同源性为97％)和结构同源性，且其保护性作用并不依赖抗体的产生。贾第虫的CWP-2是贾第虫包囊囊壁的主要成分蛋白，在贾第虫滋养体成囊过程中，由滋养体分泌产生并渗入囊壁。本专利技术创造性地提出分别针对滋养体和包囊两个阶段联合应用的二价疫苗，以实现抑制滋养体的形成从而阻断致病以及抑制包囊的形成从而切断传播。本专利技术采用α1-giardin(α1-贾第素)和CWP-2(cystwallprotein-2，囊壁蛋白)分别作为二价疫苗中抗贾第虫滋养体感染和抑制贾第虫成囊的抗原。许多人或动物的病原体感染发生在黏膜部位或由黏膜入侵。黏膜免疫系统是机体抗感染的第一道免疫屏障。在消化道、呼吸道和生殖系统等器官表面都覆盖着一层黏膜，能将机体的内环境和外界分隔，有效地将致病因子和对机体有害的物质阻断。黏膜内免疫细胞占机体内所有免疫细胞的80％，在机体的免疫保护中占有非常重要的地位。对于贾第虫等肠道寄生原虫，主要刺激肠黏膜产生分泌型IgA(sIgA)抗体，通过黏膜免疫途径可能会大大提高免疫接种的效果。同时就研制阻断贾第虫病传播的兽用疫苗而言，以饵料或饲料饲喂的免疫途径，通过有效控制病畜的感染达到控制贾第虫病的目的，发展口服疫苗显然是一种简单有效的途径。目前，通过饵料或饲料喂食途径的各种兽用疫苗普遍存在的问题在于很难保障动物喂食的量。本专利技术利用贾第虫α1-giardin和CWP-2的抗原表位，构建二价疫苗，以减毒沙门菌SL7207作为转运载体，定量制备肠溶制剂，经肠道使动物获得有效的特异性抗贾第虫感染和传播免疫。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述问题，提出有效的抗贾第虫疫苗应该包含两个主要指标，即阻断致病和切断传播。据此，本专利技术提出采用分别针对滋养体和包囊两个阶段的两种疫苗分子联合应用的二价疫苗，从而实现抑制滋养体的形成从而阻断致病以及抑制包囊的形成从而切断传播。本专利技术的一个目的在于提供一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，该疫苗能够同时阻断致病和切断传播。本专利技术的另一个目的在于提供一种包含所述二价DNA疫苗的肠溶制剂。本专利技术的再一个目的在于提供一种包含定量疫苗的肠溶制剂，以实现二价疫苗肠溶制剂的口服定量免疫。在本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，其特征在于，将贾第虫的两种抗原基因α1-giardin和CWP-2分别插入真核载体pVAX1中获得重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2，将所述重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，所述重组菌构成所述二价DNA疫苗，其中所述抗原基因α1-giardin为SEQIDNO：1序列，所述抗原基因CWP-2为SEQIDNO：3序列。在一个优选实施方案中，所述二价DNA疫苗通过以下步骤制备：(1)以贾第虫的cDNA作为模板，分别通过聚合酶链反应扩增获得α1-giardin和CWP-2基因片段，(2)将所述基因片段插入载体pVAX1的HindIII和BamHI位点之间，产生pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2重组质粒；(3)将步骤2中的重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中，得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，所述重组菌等比例混合后即得到所述二价DNA疫苗，其中，聚合酶链反应扩增中使用的引物如下：α1-giardin的引物：α1-G-F1:CCAAGCTTATGCCGAAGGTCACCGACAT(HindIII)α1-G-R2:CGGGATCCCTTCACGCGCCAGAGGGTGC(BamHI)CWP-2的引物：Gl-CWP2-F5:CCAAGCTTAGGCAGACAGTAGTCCGC(HindIII)Gl-CWP2-R5:CGGGATCCCCTTCTGCGGACAATAGGCTTG(BamHI)。在一个优选实施方案中，所述宿主菌是减毒沙门菌，即减毒沙门菌SL7207。在本专利技术的另一方面，本专利技术还提供一种用于预防人或动物贾第虫病的肠溶制剂，所述肠溶制剂包含第一方面所述的用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗。优选地，所述肠溶制剂是定量配制的，使得每份肠溶制剂包含基本相同量的所述二价DNA疫苗的重组菌。在一个优选实施方案中，所述肠溶制剂通过包括以下步骤的方法制备：1)对所述二价DNA疫苗的重组菌进行扩增培养得到培养物；2)将步骤1)中得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，其特征在于，将贾第虫的两种抗原基因α1‑giardin和CWP‑2分别插入真核载体pVAX1中获得重组质粒pVAX1‑α1‑giardin和pVAX1‑CWP‑2，将所述重组质粒pVAX1‑α1‑giardin和pVAX1‑CWP‑2分别转运进入宿主菌中得到分别包含重组质粒pVAX1‑α1‑giardin和重组质粒pVAX1‑CWP‑2的重组菌，所述重组菌构成所述二价DNA疫苗，其中所述抗原基因α1‑giardin为SEQ ID NO：1序列，所述抗原基因CWP‑2为SEQ ID NO：3序列。

【技术特征摘要】
2014.12.04 CN 20141075094551.一种用于预防人或动物贾第虫病的二价DNA疫苗，其特征在于，将贾第虫的两种抗原基因α1-giardin和CWP-2分别插入真核载体pVAX1中获得重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2，将所述重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，所述重组菌构成所述二价DNA疫苗，其中所述抗原基因α1-giardin为SEQIDNO：1序列，所述抗原基因CWP-2为SEQIDNO：3序列；所述二价DNA疫苗通过以下步骤制备：(1)以贾第虫的cDNA作为模板，分别通过聚合酶链反应扩增获得α1-giardin和CWP-2基因片段；(2)将所述基因片段插入载体pVAX1的HindIII和BamHI位点之间，产生pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2重组质粒；(3)将步骤2中的重组质粒pVAX1-α1-giardin和pVAX1-CWP-2分别转运进入宿主菌中，得到分别包含重组质粒pVAX1-α1-giardin和重组质粒pVAX1-CWP-2的重组菌，两种重组菌等比例混合后，即得到所述二价DNA疫苗；其中，聚合酶链反应扩增中使用的引物如下：α1-giardin的引物：α1-G-F1:CCAAGCTTATGCCGAAGGTCACCGACAT，其为SEQIDNO：5序列；α1-G-R2:CGGGATCCCTTCACGCGCCAGAGGGTGC，其为SEQIDNO：6序列；CWP-2的引物：Gl-CWP2-F5:CCAAGCTTAGGCAGACAGTAGTCCGC，其为SEQIDNO：7序列；Gl-CWP2-R5:CGGGAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯宪敏，郑文彧，李瑶，崔柏吉，张宏梅，
申请(专利权)人：吉林医药学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22